叶酸干预对神经管畸形鼠Pax3基因及H3K27me3的作用研究

摘要

目的：构建全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA)诱导的神经管畸形鼠模型，了解神经管畸形(neural tube defects，NTDs)形成过程中Pax3基因表达及H3K27三甲基化状态的情况，明确叶酸干预对这一现象的影响，探讨叶酸干预对神经管畸形的预防作用及可能的发生机制，为神经管畸形的早期诊疗提供可靠的理论依据。
　　方法：1.动物模型的建立：将18只性成熟健康雌性SD大鼠随机均分为3组：正常组、畸形组、叶酸干预组。其中，叶酸干预组于孕前2周喂食叶酸添加饲料（60μg/kg），直至终止妊娠；畸形组、叶酸干预组于E10d时给予ATRA100mg/kg一次性灌胃，正常组给予相同剂量橄榄油。
　　2.形态学观察：E15d剖宫取胎，对胎鼠进行形态学观察，记录胚胎总数、活胎数、死胎数、吸收胎数、畸形胎数、正常胎数，统计并分析伴发畸形率。
　　3.病理学观察：胚胎固定、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、常规切片、HE染色，显微镜下观察各组胚胎病理学改变并摄影。
　　4.血清叶酸、同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）的测定：孕鼠腹部麻醉，胸部常规消毒，心脏穿刺采血于离心管静止30min后，以3000rpm离心，取上清。以磷酸盐缓冲液10：1稀释，分装至100?l离心管上机检测。
　　5. Pax3基因表达量的测定：运用Western bloting技术和QRT-PCR技术对各组胚胎组织Pax3基因表达量进行定量分析。
　　6. H3K27me3表达的检测：运用免疫组织化学技术和Western bloting技术对各组胚胎组织H3K27me3表达量进行定性、定量分析。
　　结果：1.胎鼠畸形率统计显示正常组胎鼠未见畸形，畸形组神经管畸形的发生率98.61％，叶酸干预组35.09%。其中，正常组胎鼠总数为61只，活胎60只，死胎1只，正常胎61只，未见吸收胎及畸形胎。畸形组总数72只，活胎72只，畸形胎71，其中包括吸收胎2只，正常胎1只。叶酸干预组总数57只，活胎57只，正常胎37只，畸形胎20只，未见吸收胎；
　　2.病理学观察可发现正常组胎鼠发育正常，组织结构层次清晰。畸形组显性脊柱裂胎鼠背侧皮肤及皮下组织出现卵圆形缺损，深部脊髓结构紊乱，向外膨出，常伴有炎性细胞浸润。叶酸干预组脊柱裂位置较畸形组低，缺损面积小，损害程度低；
　　3.正常组、畸形组、叶酸干预组孕鼠血清叶酸含量分别（62.350±10.678）ng/ml、（46.650±6.143）ng/ml、（117.375±6.564）ng/ml，血清Hcy含量分别为（2.875±0.419）μmol/l、（4.825±0.448）μmol/l、（3.500±0.265）μmol/l；
　　4.免疫组化阳性结果显示，正常组有（－）表达2例，（＋）表达10例；畸形组（＋＋）表达1例，（＋＋＋）表达11例；叶酸干预组（＋＋）表达9例，（＋＋＋）表达3例，正常组H3K27me3处于低表达状态，而畸形组呈现强阳性表达（P＜0.05）。叶酸干预组表达量比畸形组有所下降，但是并没有表现出差异性，与正常组相比，差异性明显，有统计学意义（P＜0.05）；
　　5. Western bloting蛋白检测显示畸形组Pax3基因表达量显著降低，而叶酸干预组表达量明显上调，并恢复至正常水平，H3K27三甲基化水平呈现负相关性；
　　6. QRT-PCR检测Pax3基因表达量所得结果与Western bloting蛋白检测结果呈现一致性。
　　结论：1.叶酸能够有效降低全反式维甲酸诱导的鼠神经管畸形发生率；
　　2.神经管畸形鼠中Pax3基因表达下调，H3K27三甲基化水平升高，叶酸干预可以有效纠正这一现象；
　　3.神经管畸形的发生及叶酸的保护与Pax3基因表达及H3K27三甲基化状态存在紧密的联系。

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前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

结果

1 胎鼠形态学观察及畸形率统计结果

2 孕鼠血清叶酸、Hcy含量

3 病理学观察

4 Western bloting检测结果

5 Pax3基因荧光定量PCR检测结果

讨论

结论

参考文献

综述: 高同型半胱氨酸血症与相关疾病的研究进展

致谢

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