经重组抗原P29诱导的免疫保护下细粒棘球蚴感染宿主后长链非编码RNA差异表达的筛选

摘要

目的：
　　为了研究长链非编码RNA是否参与了宿主免疫细胞分化的过程，本课题利用重组疫苗P29对动物具有较好免疫保护力的作用，制备了疫苗免疫-病原体感染动物模型。在此基础上研究在重组疫苗P29免疫诱导下及病原体感染后，长链非编码RNA差异表达的情况，为解决寄生虫病研究中存在的宿主与病原体间免疫相互作用及免疫逃逸等难题探索新的途径。
　　方法：
　　1.纯化和制备细粒棘球绦虫重组疫苗P29。
　　2.疫苗免疫-病原体感染动物模型的制备：将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、P29免疫+感染组和未免疫感染组。用重组疫苗免疫P29免疫+感染组小鼠（免疫3次），与第三次免疫间隔三个月后用细粒棘球绦虫原头蚴感染小鼠（空白对照组不感染）。分别在第一次免疫前、第三次免疫后2周、感染病原体后2周，小鼠眼球取血制备外周血淋巴细胞。感染6个月后处死P29免疫+感染组和未免疫感染组小鼠，统计包囊数，计算出重组疫苗P29所引起的免疫保护力。
　　3.提取总RNA：利用TRIZOL法提取各组小鼠各个时间点的外周血淋巴细胞中总RNA。
　　4.构建lncRNA和mRNA序列文库：用Epicentre公司的Magnetic Core试剂盒进行lncRNA的分离及建库，用KAPA公司的KAPA Strand mRNA-SeqKit进行mRNA的分离及建库。用2％琼脂糖凝胶电泳切胶回收纯化后，用Agilent2100检验文库质量。
　　5.高通量测序：构建好的lncRNA和mRNA序列文库用Illumina公司HiSeq2000高通量测序仪进行测序分析。
　　6.生物信息学方法对测序碎片进行拼接：用tophat2软件进行拼接，将高质量reads比对到小鼠基因组上，并构建各组、各时间点的lncRNA和mRNA转录本。
　　7.生物信息学方法筛选差异表达分子：用Cufflinks软件对全部reads正态分布化，获得可以相互比较的表达数据，用Cuffdiff软件按照P value≤0.05且fold change≥2标准对实验组及对照组免疫后2周、感染病原体后2周的lncRNA及mRNA表达量进行差异分析。
　　8.注释：使用lncRNAdb数据库（http://www.lncRNAdb.org/）、UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu/)注释差异表达的lncRNA。
　　9.lncRNA与对应mRNA的关联性分析：通过计算实验组及对照组各个时间点差异表达lncRNA及mRNA表达量的皮尔森系数（r），以r的绝对值大于0.99为阈值，确定lncRNA与mRNA的相关关系。
　　10.对P29免疫+感染组及空白对照组免疫后差异表达lncRNA及相关mRNA分子进行初步验证：将BALB/c小鼠随机分为空白组，免疫组，免疫组小鼠经重组疫苗P29免疫3次，空白组不做处理，分别在第一次免疫前、第三次免疫后两周眼球取血制备外周血淋巴细胞。TRIZOL法提取总RNA，构建cDNA文库。利用荧光定量PCR技术对差异表达的lncRNA及相关mRNA分子进行初步验证。
　　结果：
　　1.成功构建疫苗免疫-病原体感染动物模型，重组疫苗 P29免疫小鼠获得了94.8%的免疫保护力。
　　2.成功提取总RNA，经核酸蛋白微量分析仪测定各组总RNA OD260/OD280均在1.8-2.0之间，总量均超过5μg，满足建库要求。
　　3.成功构建mRNA文库及lncRNA文库，通过Agilent2100检验，符合测序要求。
　　4.mRNA文库测序结果：P29免疫+感染组免疫后mRNA文库获得19717433条reads，其中高质量reads共12375673条，比对率为94.2％。P29免疫+感染组感染后mRNA文库获得24908555条reads，其中高质量reads共14766919条，比对率为94.8％。空白对照组免疫后mRNA文库获得25555287条reads，其中高质量reads共15703026条，比对率为96.1％。空白对照组感染后mRNA文库获得23772436条reads，其中高质量reads共15251560条，比对率为96.3％。未免疫感染组感染后mRNA文库获得21539925条reads，其中高质量reads共13748866条，比对率为95.1％。各文库测序量均在4Gb以上。
　　5.lncRNA文库测序结果：P29免疫+感染组免疫后lncRNA文库获得23367854条reads，其中高质量reads共16756424条，比对率为85.1％。P29免疫+感染组感染后lncRNA文库获得21803045条reads，其中高质量reads共16449971条，比对率为87.6％。空白对照组免疫后lncRNA文库获得25501392条reads，其中高质量reads共18047705条，比对率为84.7％。空白对照组感染后lncRNA文库获得21803045条reads，其中高质量 reads共16449971条，比对率为87.6％。未免疫感染组感染后lncRNA文库获得18171176条reads，其中高质量reads共12521894条，比对率为95.1％。各文库测序量均在4Gb以上。
　　6.筛选差异表达分子结果：P29免疫+感染组和空白对照组免疫后差异表达的lncRNA共17个，mRNA共473个。空白对照组与未免疫感染组感染后差异表达的lncRNA共14个，mRNA共85个。P29免疫+感染组和未免疫感染组感染后差异表达的lncRNA共30个，mRNA共192个。
　　7.lncRNA与对应mRNA的关联性分析结果：每个差异表达的lncRNA与多个编码蛋白基因显著相关。
　　8.初步验证结果：对P29免疫+感染组及空白对照组免疫后差异表达lncRNA及相关mRNA进行qPCR验证，其中lncRNA靶分子XLOC-012763与对应mRNA Dab2ip、Hc、Trem、Oas3；INTE-015204与对应mRNA klf4、Patz1、Cxcl2；INTE-028466与对应mRNA Kler1、Jchain存在差异表达，与lncRNA与对应mRNA关联性分析结果一致。
　　结论
　　1.获得疫苗诱导下差异表达lncRNA共17个，mRNA共473个。获得病原体感染下差异表达的 lncRNA共14个，mRNA共85个。获得疫苗诱导病原体感染差异表达lncRNA共30个，mRNA共192个。
　　2.初步认定lncRNA XLOC-012763与对应mRNA Dab2ip、Hc、Trem、Oas3；INTE-015204与对应mRNA klf4、Patz1、Cxcl2；INTE-028466与对应mRNA Kler1、Jchain是与获得免疫保护力相关的、可能参与诱导宿主机体免疫应答调节作用的靶lncRNA及靶mRNA，为解决寄生虫病研究中存在的宿主与病原体间免疫相互作用及免疫逃逸机制提供线索。

目录

声明

中英文缩略词表

前言

实验材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学方法

2 包囊检测及保护力的结果

3 构建文库及2100检验结果

4 高通量二代测序后得到原始数据

5 利用生物信息学软件分析测序数据筛选P29免疫+感染组和空白对照组免疫后差异表达的具有统计学意义的候选分子结果

6 利用生物信息学分析原始数据筛选出空白对照组与未免疫感染感染后差异表达的具有统计学意义的候选分子

7 利用生物信息学分析原始数据筛选出P29免疫+感染组与未免疫感染组感染后差异表达的具有统计学意义的候选分子

8 差异表达 lncRNA与对应mRNA的关联性分析结果，以相关系数绝对值大于0.99为阈值

9 对P29免疫+感染组及空白对照组免疫后差异表达lncRNA及相关mRNA分子进行初步验证结果

讨论

结论

参考文献

附录

综述:长链非编码RNA的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

个人简历