大鼠增殖抑制基因过表达对C6胶质瘤细胞侵袭的抑制作用及其机制的研究

摘要

目的：
　　研究大鼠增殖抑制基因（rat hyperplasia suppressor gene，rHSG）过表达对C6胶质瘤细胞侵袭的影响，并研究其可能的调节机制。
　　方法：
　　用携带rHSG基因序列的重组腺病毒Adv-rHSG-GFP感染C6胶质瘤细胞，同时设置Adv-GFP感染的阴性对照组以及仅 PBS处理的空白对照组。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞中 rHSG的表达变化。然后，采用细胞划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别检测rHSG过表达对C6胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响，细胞免疫荧光法和细胞黏附实验分别分析rHSG过表达后 C6细胞骨架形成和黏附能力的变化，实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）测定各组细胞中 Rho/Rock信号通路关键分子Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family,member A，RhoA）、Ras相关的C3肉毒底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1，Rac1）、细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle42，Cdc42）、 Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1（Rho associated coiled-coil forming protein kinase1，Rock1）和Rock2的表达水平。
　　结果：
　　1、Adv--GFP、Adv-rHSG-GFP分别感染C6胶质瘤细胞48 h、72 h后，利用RT-PCR及Western Blot检测发现：与Adv-GFP组及PBS组相比，Adv-rHSG-GFP组中C6胶质瘤细胞rHSG的mRNA、蛋白表达水平均明显升高（P值均＜0.01）；Adv-GFP组与PBS组相比，两组之间mRNA、蛋白均无明显差异（P＞0.05）。
　　2、划痕愈合实验发现：在划痕30 h后，Adv-rHSG-GFP组分别与Adv-GFP组及PBS组相比，C6胶质瘤细胞的划痕愈合率明显下降（P值均＜0.01）；Adv-GFP组与PBS组相比，C6胶质瘤细胞在两组之间的划痕愈合率无明显差异（P＞0.05）。
　　3、Transwell实验发现：C6胶质瘤细胞在Transwell上室培养24h后，Adv-rHSG-GFP组分别与Adv-GFP组及PBS组相比，迁移、侵袭至下室的细胞数均明显减少（P值均＜0.01）。Adv-GFP组与PBS组相比，两组迁移、侵袭的细胞数之间均无明显差异（P＞0.05）。
　　4、细胞黏附实验发现：在黏附不同时间（30、60、90和120 min），与Adv-GFP组及PBS组相比，C6胶质瘤细胞在Adv-rHSG-GFP组的黏附细胞数均明显减少（P值均＜0.05），且随着时间的延长，差异逐渐缩小。Adv-GFP组与PBS组相比，两组之间黏附细胞数均无明显差异（P＞0.05）。
　　5、细胞免疫荧光实验发现：重组腺病毒 Adv-rHSG-GFP感染48 h后，Adv-GFP组与PBS组的C6胶质瘤细胞形态未发生明显变化，多呈长梭形或星形，伸出较多轴突，呈线状伪足，伪足多向两端伸展且成轴向排列；而Adv-rHSG-GFP组的C6胶质瘤细胞骨架发生明显调整，丝状伪足缩短，部分成片状且排列杂乱。
　　6、实时荧光定量PCR及蛋白质印记实验发现：重组腺病毒Adv-rHSG-GFP感染48 h和72 h后，与Adv-GFP组及PBS组相比，Adv-rHSG-GFP组C6胶质瘤细胞Rho/Rock信号通路中关键分子RhoA、Rac1、Cdc42、Rock1和Rock2的mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P值均＜0.05）；Adv-GFP组与PBS组相比，两组之间各分子mRNA及蛋白表达均无明显差异（P＞0.05）。
　　结论：
　　1、病毒感染成功，重组腺病毒Adv-rHSG-GFP感染48 h和72 h时，rHSG在C6胶质瘤细胞中成过表达状态。
　　2、当rHSG在C6胶质瘤细胞中表达增高时，细胞的迁移、侵袭、黏附能力均受到明显抑制。
　　3、rHSG过表达抑制C6胶质瘤细胞的骨架形成，促使细胞丝状伪足缩短且重新排列。
　　4、Rhsg过表达促使C6胶质瘤细胞中Rho/rock信号通路关键分子Mrna及蛋白表达水平降低，说明Rhsg可能是通过阻碍Rho/rock信号通路抑制C6胶质瘤细胞的侵袭。

目录

声明

符号说明

前言

材料和方法

1.实验材料

2.实验方法：

结果

3.1 腺病毒在C6胶质瘤细胞的感染及表达情况

3.2 rHSG过表达对C6胶质瘤细胞迁移的影响

3.3 rHSG过表达对C6胶质瘤细胞侵袭的影响

3.4 rHSG过表达对C6胶质瘤细胞黏附能力的影响

3.5 rHSG过表达对C6胶质瘤细胞骨架的影响

3.6 rHSG过表达对C6胶质瘤细胞Rho/Rock信号转导通路相关分子转录情况的影响

3.7 rHSG过表达对C6胶质瘤细胞Rho/Rock信号转导通路相关分子翻译情况的影响

讨论

结论

参考文献

综述:RhoGTP酶在胶质瘤侵袭中的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文