利用CRISPR/Cas9技术构建CREB基因敲除细胞系并探讨CREB对APP基因的表达调控作用

摘要

目的 淀粉样前体蛋白APP是一个多功能的跨膜蛋白，能够促进神经元的分化和突触的形成。在病理情况下，淀粉样前体蛋白的异常水解可形成一种由42个氨基酸组成的淀粉样多肽片段，该片段的沉积可对神经元产生不可逆的损害作用并导致记忆力下降，因此也被认为是引起阿尔茨海默病的一个重要的假说。阿尔茨海默病是一种常见的神经退行性疾病。环磷腺苷效应元件结合蛋白CREB是重要的核转录因子。有研究发现，AD患者大脑中CREB含量下降，APP蛋白含量明显上升，然而CREB对APP的调控作用还不清楚。因此我们利用了CRISPR/Cas9技术将小鼠海马神经元细胞系（HT22细胞系）中CREB基因敲除，进一步探讨CREB对于APP的表达调控作用，并探讨其具体作用机制。 方法 1. 构建pX459-CREB质粒；将设计好的三组sgRNA插入到pX459质粒当中； 2. 验证pX459-CREB质粒的活性；将构建好的pX459-CREB-1/2/3质粒转染进HT22细胞中，提取全基因组DNA进行检测，利用短链PCR测序法和T7E1酶切法验证构建质粒的活性； 3. 利用pX459-CREB质粒构建CREB基因敲除的HT22细胞系，进行Western blot实验和qPCR实验验证细胞系中CREB的敲除效果，挑选敲除效果最好的细胞系进行后续实验； 4. 通过Western blot实验检测CREB和APP在蛋白水平上的表达； 5. 通过Western blot实验检测其他通路上各因子(GSK-3β、p300、P52、IKBα）的表达水 平。 结果 1. 经过酶切鉴定和测序分析，CREB sgRNA1、2、3已经成功构建在pX459质粒当中，pX459-CREB1/2/3质粒与最初设计完全吻合； 2. pX459-CREB1对应的CREB序列出现重复，不能PCR扩增进行活性检测。短链PCR测序结果显示在pX459-CREB2、3转染的细胞DNA中出现明显基因缺失和碱基突变，T7E1 酶切结果显示 pX459-CREB2、3 转染后细胞 DNA 出现碱基突变。证明pX459-CREB2、3是具有活性的； 3. 将pX459-CREB1、2、3转染至细胞中进行筛选培养后，培养出稳定传代的细胞系，qPCR结果和Western blot结果显示各细胞系之间的敲除效率有一定差异，敲除比例均在70%以上，其中CREB2-3组敲除效率最好达到了90%，以该组细胞进行之后实验。 4. Western blot结果显示，当细胞内CREB基因被敲除后，细胞内的APP蛋白表达量明显上升，而在另外CREB在Neruro-2A细胞中过表达时，CREB蛋白含量表达增高，而APP蛋白含量出现表达降低的现象。 5. Western blot结果显示，当细胞内CREB基因被敲除后，细胞内的GSK-3β含量升高，p300含量升高，P52含量升高，IKB-α含量降低。 结论 1. 成功构建pX459-CREB1、2、3质粒，并验证具有活性； 2. 建立稳定的CREB基因敲除细胞系； 3. CREB缺失能够增强APP蛋白的表达，可能是通过GSK-3β、P300、P52、IKBα来调节的。

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