卵巢玻璃化冷冻及移植过程中自噬对卵泡存活的作用研究

摘要

目的：医疗技术的提高使得癌症患者的存活率显著增加，随之而来的是癌症患者对生育力保存的需求也大大增加。卵巢组织玻璃化冻存后移植，也成为癌症患者生育力保存的重要方法之一，尤其是对青春期前女性，卵巢组织玻璃化冻存是她们保存生育力的唯一可选途径。但是，冻存后卵巢组织复苏后移植到女性体内，会出现较高的异常卵母细胞和卵巢空泡化的现象。因此，保护移植后的卵巢组织中的卵泡，特别是原始卵泡就显得尤为重要。已有研究表明自噬可以抗深低温损伤进而保护细胞存活，而且Ⅱ型程序性细胞死亡-自噬（autophagy），参与调控各级卵泡的闭锁，但是自噬在卵巢组织玻璃化冻存及移植过程中对卵泡是如何作用的，其作用机制是什么，尚不清楚。本研究拟以21日龄雌性ICR小鼠卵巢为模型，应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine，3-MA，抑制自噬体的形成）、巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1，Baf1，与溶酶体结合抑制自噬体的降解）和自噬激活剂雷帕霉素（rapamycin，RaPa）干预卵巢玻璃化冻存及移植过程，探讨自噬在卵巢玻璃化冻存及移植过程中的作用及机制。 方法：实验一：自噬在卵巢组织玻璃化冻存过程中的作用研究。实验分为五组：新鲜卵巢对照组，渗透保护剂处理组（cryoprotectant，CPA）、玻璃化冻存组、玻璃化冻存自噬抑制组（包括抑制剂3-MA组和Baf1组）、玻璃化冻存自噬激活剂组（RAPA组）。应用组织学方法及卵泡计数，探究自噬调控对冻融卵巢的影响，筛选最适的自噬干预浓度；通过western-blot检测自噬标志分子LC3的表达变化；TUNEL原位杂交及Cleaved Caspase-3免疫荧光技术探究自噬上调或下调后卵泡及颗粒细胞的凋亡情况；通过电镜检测自噬体的形成，探讨玻璃化冻存过程中是否存在自噬，自噬的作用环节、自噬在玻璃化冻存过程中对卵巢是保护（抗损伤）还是促进卵泡闭锁。 实验二：自噬在卵巢组织玻璃化冻存后移植过程中的作用研究。实验分为两大组：第一大组新鲜卵巢移植组；第二大组为玻璃化冻存卵巢移植组。第一大组中移植卵巢供体为21日龄雌性ICR小鼠，受体为6-8周龄成年雌性ICR小鼠。第一大组又分为3个小组：新鲜卵巢移植组（给受体小鼠提前48 h、24h腹腔注射生理盐水）、小剂量3-MA干预新鲜卵巢移植组（给受体小鼠提前48 h、24h腹腔注射3-MA 3.75 mg/kg，移植前30min再次腹腔注射3-MA 3.75 mg/kg，将供体小鼠卵巢移植到受体鼠的肾被膜下）、大剂量3-MA干预新鲜卵巢移植组（给受体小鼠提前48、24h腹腔注射3-MA 7.5 mg/kg，移植前30min再次腹腔注射3-MA 7.5 mg/kg，将供体小鼠卵巢移植到受体鼠的肾被膜下）；第二大组中移植卵巢供体为21日龄雌性ICR小鼠玻璃化冻存后解冻卵巢，受体为6-8周龄成年雌性ICR小鼠。第二大组也分为3个小组：玻璃化冻存卵巢移植组（给受体小鼠提前48 h、24 h、移植前30 min再次腹腔注射腹腔注射生理盐水）、小剂量3-MA干预玻璃化冻存卵巢移植组（给受体小鼠提前48h、24h腹腔注射3-MA 3.75 mg/kg，移植前30min再次腹腔注射3-MA 3.75 mg/kg，将供体小鼠卵巢移植到受体鼠的肾被膜下）、大剂量 3-MA干预玻璃化冻存卵巢移植组（给受体小鼠提前48h、24h腹腔注射3-MA 7.5 mg/kg，移植前30min再次腹腔注射3-MA 7.5 mg/kg，将供体小鼠卵巢移植到受体鼠的肾被膜下）。应用组织学方法及卵泡计数方法，探究受体自噬干预对移植后卵泡存活的作用；应用免疫组织化学技术检测卵巢中CD31、CD34的表达，进行微血管计数，观察自噬对移植后卵巢血管生成的影响。 结果：实验一：卵巢组织经玻璃化冻存之后，颗粒细胞排列有序，卵泡形态保存较好；与新鲜及玻璃化组卵巢比较，渗透保护剂组、3-MA组、Baf1组、RaPa组卵巢组织形态较差，卵泡排列分散，间质结构比较松散，还存在卵母细胞和颗粒细胞核固缩。卵泡计数统计结果显示，与新鲜卵巢组和玻璃化冻存组比较，原始卵泡在 CPA 组、3-MA 组和 RaPa组中数量显著降低（P<0.05）；窦卵泡在CPA组、3-MA组和RaPa组与新鲜组相比显著降低（P<0.05）；闭锁卵泡在 CPA 组、3-MA 组、Baf1 组和 RaPa 组与新鲜组比较显著增加（P<0.05）。Cleaved Caspase-3免疫荧光与TUNEL法检测凋亡的结果一致，凋亡主要发生在颗粒细胞和卵母细胞。与新鲜组相比较，玻璃化组、CPA组、3-MA组、Baf1组和RaPa 组的凋亡率有显著升高（P<0.05），通过Western-blot又得到了进一步的验证，与新鲜组相比，玻璃化组、CPA组、3-MA组、Baf1组和RaPa组中Cleaved Caspase-3的表达明显增加（P<0.05）；通过Western-blot检测自噬标记分子LC3，与新鲜组相比，玻璃化组中LC3的表达明显增加（P<0.05）。 实验二：卵巢组织形态学分析，与玻璃化冻存移植组相比，新鲜卵巢移植2天卵巢形态相对保持完整，但有卵泡丢失、卵泡闭锁增加，特别是原始卵泡丢失较多，且有许多受损基质细胞；随着移植时间的延长，卵巢卵泡丢失、基质细胞受损情况更加严重，卵巢纤维化较为严重。在玻璃化冻存解冻后小鼠卵巢移植组中，与自噬抑制剂3-MA组相比，新鲜移植组卵泡丢失、纤维化明显；在移植后42天检测不到原始卵泡，而自噬抑制剂3-MA组中可以检测到原始卵泡。通过对玻璃化冻存后移植卵巢CD31、CD34免疫组化结果进行微血管计数结果显示：移植42天时，与对照组比较，3-MA组的CD31、CD34抗体阳性标记的微血管数量显著增加（P<0.05）。 结论：（1）玻璃化冻存过程中可能会激活自噬，激活自噬可能起到抗深低温损伤的作用，进而保护原始卵泡存活。 （2）玻璃化冻存卵巢移植过程中自噬的过度激活可能是卵泡丢失的主要原因，而抑制自噬可以增加血管的形成，同时对卵泡存活起保护作用，特别是可以保护原始卵泡的存活，增加卵巢储备。

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