木香烃内酯对氧糖剥夺再灌注致小鼠脑片及PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

摘要

目的：研究木香烃内酯（Costunolide，CT ）对氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）致小鼠脑片和PC12细胞损伤的保护作用及其机制。 方法：（1）建立小鼠脑片OGD/R损伤模型，实验分为六组，分别为Control组，OGD/R 组，OGD/R+Nim10μM 组，OGD/R+CT1μM 组，OGD/R+CT5μM 组和OGD/R+CT10μM组。采用乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）释放实验和脑片 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）染色实验评价脑片的活性和损伤程度，采用 Western blot 法检测细胞凋亡线粒体途径相关蛋白 Bcl-2、Bax、Cyto-c、Caspase-9、Caspase-7和Caspase-3的表达水平。 （2 ）建立 PC12 细胞 OGD/R 损伤模型，实验分为 Control 组 ，OGD/R 组，OGD/R+Nim5μM组，OGD/R+CT2.5μM组，OGD/R+CT5μM组和 OGD/R+CT10μM组。采用光镜观察 PC12细胞形态学变化；CCK-8法检测细胞存活率；采用 LDH试剂盒检测细胞培养液中LDH的活力；Annexin V-FITC/Propidium Iodide双染流式细胞术检测PC12细胞的凋亡率；JC-1 染色检测 PC12细胞线粒体膜电位变化；Fluo-3/AM 荧光染色法检测PC12细胞中钙离子水平；利用Western blot 检测Bcl-2、Bax、Cyto-c、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-7和 Caspase-3蛋白的表达水平；采用细胞免疫荧光法检测 Bcl-2、Bax、Cyto-c和Caspase-3蛋白的表达水平。 结果：（1）在小鼠脑片实验中，TTC 染色实验结果显示，与 Control 组比较，OGD/R组脑片 TTC染色 A490处的OD490值明显降低（p<0.05），木香烃内酯 1μM、5μM、10μM三个剂量组脑片 TTC染色 A490处的OD490值明显升高（p<0.05）；LDH释放量实验结果显示，与Control组比较，OGD/R组LDH释放量明显升高（p<0.05），与OGD/R组比较，木香烃内酯 1μM、5μM、10μM三个剂量组脑片孵育液中 LDH的释放量明显减少（p<0.05）；Western blot检测结果显示，与 Control组比较，OGD/R组 Bax、Cyto-c、Caspase-9、Caspase-7 和 Caspase-3 蛋白的表达均有明显升高，而Bcl-2 蛋白的表达量均有明显降低，与 OGD/R 组比较，木香烃内酯 1μM、5μM、10μM组Bax、Cyto-c、Caspase-9、Caspase-7和 Caspase-3蛋白的表达均明显降低，而Bcl-2蛋白的表达量均有明显升高。 （2 ）在 PC12 细胞实验中，木香烃内酯对 PC12 细胞形态的影响结果显示，OGD/R 组细胞胞体肿胀，细胞活性降低，部分细胞变圆或呈现漂浮状态；与 OGD/R组相比，木香烃内酯 2.5μM、5μM、10μM组细胞的胞体比较饱满，胞膜比较光滑完整，贴壁良好，大部分交织成网状结构；CCK-8法检测结果显示，与OGD/R组相比，木香烃内酯2.5μM组和木香烃内酯5μM组细胞存活率明显升高（p<0.05），LDH活力实验结果显示与OGD/R组相比，木香烃内酯2.5μM、5μM、10μM三个剂量组PC12细胞培养液中 LDH的活力明显降低（p<0.05）；流式细胞术对 PC12 细胞凋亡率的检测结果显示与OGD/R组相比，木香烃内酯2.5μM、5μM 、10μM组细胞凋亡率均有一定程度的降低，JC-1染色检测线粒体膜电位的结果显示，OGD/R组细胞红色荧光减弱，呈现出高绿低红，与OGD/R组相比，木香烃内酯5μM组红色荧光明显增强（p<0.05），而木香烃内酯2.5μM、10μM组红色荧光增强不明显；木香烃内酯对OGD/R损伤后PC12细胞内 Ca2+浓度变化的影响结果显示，OGD/R 组细胞绿色荧光很强，而木香烃内酯2.5μM，5μM，10μM 三个剂量组绿色荧光减弱；Western Blot 检测结果显示，OGD/R组 Bcl-2的表达降低，而 Bax、Cyto-c、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-7和 Caspase-3的表达升高，与 OGD/R组相比，木香烃内酯组能够使抗凋亡蛋白 Bcl-2表达量升高，使促凋亡蛋白 Bax 表达量下降，使 Cyto-c 和 Apaf-1 蛋白的表达下降，使 Caspase-9、Caspase-7 和 Caspase-3 蛋白的表达下降；细胞免疫荧光法对 Bcl-2、Bax、Cyto-c 和Caspase-3 蛋白的表达水平的检测结果显示，木香烃内酯能够使 Bcl-2 蛋白的表达水平升高，使Bax、Cyto-c和Caspase-3蛋白的表达水平下降。 结论：木香烃内酯对小鼠脑片和 PC12细胞 OGD/R损伤具有一定的保护作用，其保护作用机制可能与调控线粒体-Cyto-c 通路，使 Bcl-2 蛋白的表达量升高，使 Bax、Cyto-c、Apaf-1、Caspase-9、Caspase-7、Caspase-3蛋白的表达量降低有关。

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