逍遥散抗慢性应激损伤对大鼠海马区GABRD、Cacnb4基因表达的影响

摘要

目的: 通过观察逍遥散抗慢性应激损伤作用对大鼠海马区 GABRD、Cacnb4 基因mRNA转录水平及其翻译产物的影响，验证前期 Agilent表达谱芯片研究分析结果，以期进一步探讨逍遥散在基因水平发挥抗慢性应激损伤作用的机制。 方法: 45只SPF级雄性Wistar大鼠随机分为A.正常对照组；B.慢性应激模型组；C.逍遥散干预组，每组 15 只，连续进行慢性应激刺激 21 天。运用体重检测和旷场实验对各组动物进行行为学评价，检测模型成功与否；采用实时荧光定量 PCR 法检测GABRD mRNA和Cacnb4 mRNA的转录水平，免疫组织化学染色法和Western blot 法检测GABRD和Cacnb4蛋白表达，验证前期Agilent表达谱芯片研究分析结果。 结果: 1.体重检测 实验前三组大鼠体重比较，差异无统计学意义（P>0.05）；实验结束后，慢性应激模型组大鼠较正常对照组大鼠体重明显减轻，差异有统计学意义（P<0.01）；逍遥散干预组大鼠体重则明显高于慢性应激模型组大鼠，差异有统计学意义（P<0.01）。 2.旷场实验 2.1 水平运动得分 实验前各组大鼠水平运动得分比较，差异无统计学意义（P>0.05），各组大鼠具有可比性；实验结束后，较正常对照组大鼠水平运动得分，慢性应激模型组大鼠明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；逍遥散干预组大鼠水平运动得分则明显高于慢性应激模型组大鼠，差异有统计学意义（P<0.01），但是低于正常对照组大鼠，且差异有统计学意义（P<0.01）。 2.2 垂直运动得分 实验前各组大鼠垂直运动得分比较，差异无统计学意义（P>0.05），各组大鼠具有可比性；实验结束后，较正常对照组大鼠垂直运动得分，慢性应激模型组大鼠明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；较慢性应激模型组大鼠垂直运动得分，逍遥散干预组大鼠则明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。 3. Agilent表达谱芯片前期研究分析结果 与正常对照组比较，慢性应激模型组大鼠海马区 GABRD 基因相对表达值明显下调，差异有统计学意义（P<0.05），逍遥散干预组具有上调慢性应激模型大鼠海马区GABRD基因表达的趋势，但差异无统计学意义；与正常对照组比较，慢性应激模型组大鼠海马区 Cacnb4 基因相对表达值明显下调，差异有统计学意义（P<0.01），逍遥散干预后，差异亦有统计学意义（P<0.05）。 4.各组大鼠海马区GABRD、Cacnb4基因mRNA的转录水平 与正常对照组比较，慢性应激模型组大鼠海马区 GABRD基因 mRNA的转录水平明显下调，差异有统计学意义（P<0.01）；逍遥散干预后 GABRD基因 mRNA的转录水平未见上调，且明显低于慢性应激模型组表达量，差异有统计学意义（P<0.01），且较正常对照组差异有统计学意义（P<0.01）。与正常对照组比较，慢性应激模型组大鼠海马区Cacnb4基因mRNA的转录水平明显上调，差异有统计学意义（P<0.05）；逍遥散干预后 Cacnb4 基因 mRNA的转录水平明显降低，与慢性应激模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）；且与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。 5.各组大鼠海马区GABRD、Cacnb4蛋白免疫组织化学染色结果 与正常对照组相比，慢性应激模型组大鼠 GABRD 蛋白阳性表达相对值（IOD 值）明显减少，差异有统计学意义（P<0.01 ）；与慢性应激模型组比较，逍遥散干预后GABRD 蛋白阳性表达显著上调，差异有统计学意义（P<0.01），而与正常对照组比较无统计学差异。与正常对照组比较，慢性应激模型组大鼠 Cacnb4蛋白阳性表达相对值（IOD 值）明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与慢性应激模型组比较，逍遥散干预后 Cacnb4 蛋白阳性表达显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）；且低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。 6.各组大鼠海马区GABRD蛋白表达结果 与正常对照组比较，慢性应激模型组大鼠 GABRD 蛋白相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与慢性应激模型组比较，逍遥散干预后 GABRD 蛋白相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），而与正常对照组比较差异无统计学意义。与正常对照组比较，慢性应激模型组大鼠 Cacnb4蛋白相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与慢性应激模型组比较，逍遥散干预后 Cacnb4 蛋白相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；且低于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。 结论: 1.慢性应激损伤刺激通过下调GABRD基因的表达，抑制细胞膜氯离子内流及细胞膜超极化，使神经元兴奋性增强，这可能是造成一系列神经、精神紊乱症状的机制之一。逍遥散可通过对抗 GABRD 基因的这种表达变化，有效调节慢性应激引起的焦虑、紧张、抑郁、失眠等神经、精神紊乱症状。 2.慢性应激刺激可能通过调节 Cacnb4 基因转录翻译产物的表达，引起钙离子通道数量或功能发生变化或使细胞内钙库释放，导致细胞内 Ca2+超载，使得海马神经元的功能发生障碍。逍遥散可能是通过对抗 Cacnb4高表达发挥保护海马神经元细胞的作用。

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