家蝇天然抗菌肽的纯化和天蚕素的重组表达与活性分析

摘要

昆虫是生物界分布最广泛也是最为庞大的一个类群,其多样性是生物多样性的一个典型代表.昆虫抗菌肽的发现使人们逐渐了解到昆虫及其它无脊椎动物的先天免疫机制,并且认识到抗菌肽在机体防御中的重要作用.迄今为止,已经从植物、昆虫、虾、贝、两栖动物和哺乳动物如人和小鼠等生物中发现了800多种抗菌肽.抗菌肽是一类分子量低(3.0-5.0kD)、水溶性好、对热稳定、强碱性的肽类,具有广谱抗细菌活性,而且还对真菌、病毒、原生生物包括寄生虫和某些肿瘤细胞具有很强的杀伤能力.由于抗菌肽作用于细菌细胞质膜而杀死细菌的独特的作用机制,使得病原微生物不易对其产生抗性,因此,对抗菌肽结构和功能的研究有望开发出新型的可抗耐药菌的药物.基于此,我们选取了易于取材和人工饲养、繁殖周期短的家蝇为试验材料,开展了两个方面的工作.1、构建了家蝇天蚕素基因Md145成熟肽的毕赤酵母重组表达载体,筛选到了多拷贝的阳性克隆,并在酵母中进行了诱导表达.通过Tricine-聚丙烯酰胺凝胶电泳在预期的位置检测到了目的蛋白的表达,Bradford法检测第五天表达上清中的总蛋白产量是100mg·L<'-1>,管碟法检测表达产物抑菌活性的结果显示,表达上清对Gram<'->、Gram<'+>有较强的抗菌活性,且对热稳定,100℃加热20分钟仍然有活性.但存在的问题是表达量不高,而且表达不稳定,不利于规模生产、分离纯化和抗菌谱分析.同时,我们还构建了该基因的三拷贝酵母胞内表达型载体,并转化了毕赤酵母KM71.这一部分工作有待进一步的深入和探索.2、用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合液(OD<,600>=0.18)刺激家蝇二龄幼虫,48小时以后取其血淋巴.将无细胞的血淋巴酸化以后直接上Sep-Pak C<,18>柱进行固相萃取,分别以10﹪、30﹪和80﹪浓度的ACN洗脱,将各洗脱组分真空抽干,以管碟法检测抑菌活性.现已检测到三个梯度SPE组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很强的抑制作用.对10﹪的固相萃取组分利用RP-HPLC进行了纯化.利用液体生长抑制法发现其中四个组分有很强的抑菌活性.通过这部分工作,我们希望能从家蝇幼虫的血淋巴中得到天然的有抗菌活性的蛋白或小肽,并鉴定其一级结构和相关功能.

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明

缩略语

第一章综述

第一节抗菌肽分类及其结构特点

第二节抗菌肽活性谱和作用机理

第三节抗菌肽表达的相关信号通路与调控方式

第四节抗菌肽的应用前景和论文研究意义

第二章家蝇天蚕素类抗菌肽在毕赤酵母中的分泌表达和活性分析

1、材料与方法

1.1、材料与设备

1.2、试剂配方

1.3、方法与步骤

2、结果

2.1、分泌型重组表达载体的构建

2.2、转化毕赤酵母

2.3、多拷贝筛选(筛选浓度：2.0mg.mL-1)

2.4、甲醇诱导表达及产物检测

2.5、管碟法检测表达上清的抑菌活性

3、讨论

第三章毕赤酵母胞内表达型重组载体的构建

1、材料与方法

1.1、材料、设备与试剂

1.2、方法

1.2、结果

第四章家蝇幼虫血淋巴抗菌肽的纯化与性质研究

1、材料与方法

1.1、材料与设备

1.2、试剂配方

1.3、方法与步骤

1.4、结果

1.5、讨论

附录

论文总结

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表