沿海甜菜高频率诱导丛生芽体系的建立和转betA基因植株的再生

摘要

盐胁迫是一种严重影响作物生长的世界范围的逆境因子。我国有近15亿亩盐碱地。为了更好的利用这些土地，创造出耐盐新种质有重要作用。沿海甜菜是一种野生甜菜，广泛分布在地中海沿岸。沿海甜菜本身具有较强的耐盐碱性，为了提高其耐盐性，该文开展了高频率诱导丛生芽体系的建立和转betA基因及als基因植株再生的研究。 该工作中，以5个生态型的沿海甜菜幼嫩花序切段为外植体，在添加1mg/L6-BA的MS培养基上诱导不定芽发生。诱导两周后开始产生不定芽，诱导六周后不定芽的增殖率为1：20～30。花序顶端切段易产生丛生芽，诱导率超过90％。花序切段产生不定芽的速率和诱导率随生态型、花序发育期、取材部位以及取材时间而有所不同。在5月中旬取Ⅰ期花序顶端为外植体，丛生芽诱导率最高，Ⅱ期花序外植体丛生芽诱导率次之，Ⅲ期花序外植体产生丛生芽的频率最低。与来自花序较下部位的外植体相比，花序顶端外植体(0cm～0.5cm大小)产生丛生芽的频率最高，每个切段产生较多小芽。花序生长季节对丛生芽的诱导也有影响。取花序顶端为外植体，五月中旬取材丛生芽诱导率最高，八月下旬取材诱导率显著降低。 将长出3～4片叶子的单芽转入生根培养基后，一般两周内生出白色较粗壮的小根。在添加1mg/LNAA的MS培养基上，苗的生根率达到90％。移栽后的成活率达到70％～80％。 虽然早在1987年，PaulH就发现甜菜对农杆菌敏感，但由于缺乏有效的受体再生体系，甜菜遗传转化一直受到限制。工作中，以沿海甜菜的芽尖为受体，采用农杆菌介导法进行转化。为了得到耐盐和抗除草剂的双抗转化植株，该文选用pCAMBIA1300-betA-als为Mini-Ti质粒导入betA基因和als基因。沿海甜菜离体培养的丛生芽尖(2mm～3mm)经农杆菌菌液(OD600为0.3，加入100μMAS)浸染，采用负压(40kPa)，浸染时间6min，然后吸干菌液，转移到丛生芽诱导培养基上共培养3d～4d，平均有80％的芽尖成活，在加入100mg/L头孢霉素的抑菌培养基上抑菌培养后转入附加0.01mg/L绿黄隆的筛选培养基上培养两代，成活率约为30％。存活芽块恢复培养后移入生根培养基，7d后根开始发生，一般10d～15d可移入花盆，得到转化小苗。 在用农杆菌转染芽尖时，分别验证了真空渗入、共培养时间、共培养温度和乙酰丁香酮的浓度对转化率的影响。负压有助于农杆菌的侵入，对芽块损伤较小而又利于转化的压强为40kPa，浸染6min为宜。农杆菌浸染后，共培养2d～4d可提高转化频率。共培养温度以（22±1）℃为宜。 该实验转化了1015个丛生芽块的芽尖，抑菌后有560个小芽块存活，筛选出172个抗性芽块，共检测89株转化苗，其中14株为阳性株，阳性率为15.73％，转化率(阳性植株/抑菌后存活芽块数)为4.83％。 绿黄隆筛选后的抗性芽块在恢复培养15～30天后，有些细胞迅速增殖，产生较多丛生芽；有些生长缓慢，只产生少量小芽。抗性芽块在加有较高盐浓度的培养基上生长状况好于未转化芽块。在含有2％NaCl的培养基上，抗性芽块存活率和产生的丛生芽数都明显高于未转化芽块的，且生长状态较好，呈粉红色或嫩黄色。在含2％以上(包括2％、2.5％和3％)NaCl的培养基上，抗性芽尖连续培养两代，筛选出58个抗性芽块。其中有29个抗性芽块在含2％以上(包括2％、2.5％和3％)NaCl的培养基上存活率大于50％，占总抗性芽块的50％；36个抗性芽块存活率大于33.33％，占抗性芽块的62.07％。 该工作获得了上百个转化小苗，经除草剂筛选和耐盐筛选后移栽到花盆。对获得的转化植株进行PCR检测和PCR-Southern杂交，获得了预期的条带，初步认为外源基因已整合进甜菜基因组中。转化植株春化后分别浇灌盐水(1.5％、2％、3％)各15d，转化植株仍正常开花结实。而对照植株生长明显受抑制。在盐水浇灌后，60％以上对照植株抽苔晚7d～15d，有的幼嫩花序顶端发褐，停止生长；转基因植株与未浇灌盐水的植株在生长势和发育时期等方面无显著差异。

目录

原创性声明及关于学位论文使用授权的说明

缩写说明

1前言

1.1甜菜转化受体体系的建立

1.2甜菜基因工程的研究进展

1.3植物耐盐基因工程的研究进展

1.3.1盐碱地开发利用的现状及意义

1.3.2植物耐盐基因工程的策略

1.3.3提高细胞甘氨酸甜菜碱含量的基因工程

1.4抗除草剂基因工程和转基因植物安全性

1.5本工作的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株与质粒

2.1.3培养基

2.1.4药品、试剂和溶液

2.2方法

2.2.1丛生芽体系的建立

2.2.2农杆菌培养

2.2.3丛生芽尖的遗传转化和共培养

2.2.4转化小芽的抑菌筛选和定植

2.2.5 CTAB法微量提取沿海甜菜叶片DNA

2.2.6转化植株的PCR检测

2.2.7转BetA植株的PCR-Southern杂交检测

2.2.8转化植株的耐盐性测定

3结果与分析

3.1遗传转化受体体系的建立

3.1.1丛生芽的诱导与继代培养

3.1.2植株再生与移栽

3.2芽尖遗传转化和转化植株的检测

3.2.1芽尖遗传转化

3.2.2负压处理对抗性芽尖率的影响

3.2.3共培养时间对抗性芽尖率的影响

3.2.4乙酰丁香酮对抗性芽尖率的影响

3.2.5共培养温度对转化的影响

3.2.6除草剂筛选浓度的确定和抗性植株的筛选

3.2.7转化芽尖的耐盐筛选

3.2.8转化植株的PCR和PCR-Southern杂交检测

3.3转BETA基因沿海甜菜T0代植株的耐盐检测

4讨论

4.1农杆菌介导的沿海甜菜丛生芽尖遗传转化体系的建立

4.1.1沿海甜菜转基因受体系统的特点

4.1.2提高转化频率的措施

4.2转基因沿海甜菜的利用价值

图版Ⅰ

图版Ⅱ

图版Ⅲ

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文