深海适冷菌Pseudoalteromonas sp.SM9913分泌的适冷蛋白酶MCP-01的基因克隆和自溶研究

摘要

海洋中有着丰富的微生物资源,是获取新药和新酶等的宝贵资源,具有很好的开发前景。极端环境微生物是微生物学领域中研究的热点,而适冷菌是极端微生物中的一类。深海海底终年低温,因而是分离适冷菌和适冷酶的良好材料。适冷酶在低温下具有较高的催化效率,在需要低温催化的行业如洗涤、食品、奶制品、皮革加工、医药和化妆品中具有较高的应用价值,因而引起各国科学家的广泛研究和开发。自1999年以来,山东大学开展了对海洋适冷微生物和适冷酶的研究。陈秀兰等(2001)从1855米深的海底淤泥中分离到一株产适冷蛋白酶的适冷菌P. sp. SM9913。该菌株所产的适冷蛋白酶MCP-01具有典型的适冷特征。适冷蛋白酶MCP-01在低温下具有高的催化效率,对热很敏感,而且易自溶(Chen et al, 2002, Chen et al, 2003a； Chen et al, 2003b)。在此研究基础上,本论文首先对适冷菌P. sp. SM9913做了种属鉴定,然后对适冷蛋白酶MCP-01进行了基因克隆和结构分析,并对适冷蛋白酶MCP-01的自溶机制和糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响进行了研究。
　　1、产适冷蛋白酶的适冷菌SM9913的种属鉴定
　　根据适冷菌SM9913的形态特征和生理生化特征,曾鉴定适冷菌SM9913属于Pseudomonas属。本文根据大肠杆菌16SrDNA的保守序列设计引物,克隆了适冷菌SM9913的16SrRNA基因。利用blast软件,将适冷菌SM9913的16SrRNA基因序列与GenBank库中的16SrRNA基因序列进行同源分析,结果表明适冷菌SM9913的16SrRNA基因序列与Pseudoalteromonas属的多株菌的同源性最高(98~99%),表明适冷菌SM9913属于Pseudoalteromonas属。利用BIOLOG微生物鉴定系统分析了适冷菌SM9913对95种碳源的利用情况,结果适冷菌SM9913的碳源利用特征与Pseudoalteromonas属一致。因此,适冷菌SM9913属于Pseudoalteromonas属。根据对适冷菌SM9913的16SrRNA基因序列和Pseudoalteromonas属的菌的

目录

摘要

英文摘要

第一章 研究背景与立题依据

1．1 研究背景

1．1．1 适冷微生物研究进展

1．1．2 适冷酶研究进展

1．2 立题依据

1．2．1 蛋白酶及其应用

1．2．2 适冷蛋白酶及其研究进展

1．2．3 我国适冷菌、适冷酶和海洋微生物的研究状况

1．2．4 本论文的研究基础和内容

第二章 深海适冷菌株 SM9913的种属鉴定

2．1 材料和方法

2．2 结果与分析

2．2．1 深海适冷菌P．sp． SM9913的16SrDNA的克隆

2．2．2 深海适冷菌P． sp． SM9913的16SrDNA的序列测定和同源性分析

2．2．3 深海适冷菌P．sp． SM9913的唯一碳源实验

2．2．4 深海适冷菌P． sp． SM9913菌株的系统进化分析

2．3 讨论

第三章 深海适冷蛋白酶 MCP-01的基因克隆和结构分析

3．1 材料和方法

3．2 结果与分析

3．2．1 深海适冷蛋白酶 MCP-01的活性中心保守片断M4的克隆和测序

3．2．2 蛋白酶 MCP-01的基因克隆

3．2．3 蛋白酶MCP-01的结构分析

3．3 讨论

第四章 深海适冷蛋白酶MCP-01的自溶机制

4．1 材料与方法

4．2 结果与分析

4．2．1 适冷蛋白酶MCP-01的纯化

4．2．2 浓度对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

4．2．3 不同pH下温度对适冷蛋白酶MCP-01自溶和热稳定性的影响

4．2．4 pH对适冷蛋白酶 MCP-01自溶的影响

4．3 讨论

第五章 糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．1 材料与方法

5．2 结果与分析

5．2．1 海藻糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．2．2 蔗糖对适冷蛋白酶 MCP-01自溶的影响

5．2．3 三种单糖对适冷蛋白酶MCP-01自溶的影响

5．3 讨论

参考文献

本论文的创新性结果

在读博士期间发表的论文

致谢

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