棉铃虫组织蛋白酶B及前导肽的重组表达及性质研究

摘要

棉铃虫组织蛋白酶B参与胚胎发育中的卵黄蛋白水解过程，本实验室前期工作从棉铃虫卵巢中纯化到一种半胱氨酸蛋白酶，通过氨基酸序列分析鉴定为组织蛋白酶B。该蛋白酶具有高水解活性和广泛的底物水解能力，能够耐受1％SDS和pH8.6的还原性电泳条件，作用的温度范围在30～50℃，在干燥条件下可以在室温存放至少2个月不丧失活性，最适pH为3～4，在高pH条件下也有一定活性。进而又克隆到了该蛋白酶的全长cDNA(GenBankAF222788)，是国际上鳞翅目昆虫中首次克隆到组织蛋白酶B基因。进一步用纯化的蛋白酶制备了特异性抗血清，根据cDNA序列合成了地高辛标记的RNA探针，对该蛋白酶的组织分布、合成部位、表达调控等进行了系统研究。在此基础上，我们拟对棉铃虫组织蛋白酶B(HelicoverpaarmigeraCathepsinB，HCB)的酶原和活化形式(MHCB)进行基因工程表达，建立在体外活化该蛋白酶原的方法，阐明酶原活化的机理，同时对棉铃虫组织蛋白酶B酶原的前导肽进行基因工程表达，研究前导肽与酶原活化的关系。同时获得可应用于生产和研究的棉铃虫组织蛋白酶B的基因工程产品。 以棉铃虫卵巢cDNA为模板，扩增HCB和MHCB基因，在大肠杆菌融合蛋白表达系统中进行了表达。由于组织蛋白酶B有14个半胱氨酸，在大肠杆菌中表达往往形成包涵体。经过复性可以得到该蛋白酶酶原，但在酶原活化的研究中没有象文献报道的那样通过酸活化或自身活化得到有活性的蛋白酶。同时用重组表达的MHCB免疫家兔制备了多克隆抗体。这些在实验室前期工作中已取得初步成果，论文工作主要是在真核毕赤酵母表达系统中，构建了重组表达载体HCB-pPIC9K，转化酵母感受态细胞KM71，表达得到分子量约为37kDa的产物，免疫印迹鉴定为棉铃虫组织蛋白酶B，具有蛋白水解活性。 同时对棉铃虫组织蛋白酶B酶原的前导肽进行了基因工程表达，并对产物进行了纯化，证明其对棉铃虫组织蛋白酶B水解BSA的活性有抑制作用。 实验过程中发现，棉铃虫组织蛋白酶B在免疫印迹分析中显示迁移率减慢，通过在样品缓冲液中加入6M的脲可以恢复正常迁移率，其他的方法比如低的加热温度，高浓度的DTT，煮沸时间的长短或者2％的SDS都不能提高蛋白在免疫印迹中的迁移率，说明该蛋白质迁移率减慢可能是由于在免疫印迹的SDS-PAGE中引起的蛋白聚合。本文建立的这种样品处理方法提供了研究SDS-PAGE和免疫印迹中聚合蛋白的方法。

目录

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摘要

符号说明

第一部分综述

第二部分棉铃虫组织蛋白酶B酶原及成熟形式在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

第三部分HCB前导肽序列HCBI100在毕赤酵母中的表达纯化及其对HCB活性的影响

第四部分HCB在免疫印迹分析中的迁移率变化及解决方法

论文总结

参考文献

致谢

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