hBmp4前导肽与成熟肽在毕赤酵母中的融合表达及其对成熟肽折叠的影响

摘要

骨形态发生蛋白(BoneMorphogenesisProteins，BMPs)是一类具有诱骨活性的蛋白质生长因子。骨形态发生蛋白-4(BMP4)是BMPs中诱导成骨活性较强的一种。目前已有研究者尝试在不同的表达系统中进行重组表达，但是在表达产物中，无法获得活性较高的二聚体形式的蛋白。BMP4在胞内是以前体的形式合成的，包括信号肽、前导肽和成熟肽三个部分。研究表明，在目前发现的绝大部分的以含前导肽的前体形式合成的蛋白质在其前导肽不存在的情况下均无法正确折叠。因此认为，Pro肽在某些蛋白质的折叠过程中扮演了分子内分子伴侣(IMC)的角色。本研究希望在毕赤酵母中将BMP4前导肽与成熟肽融合表达，以此来探讨BMP4前导肽在辅助成熟肽的折叠以及二硫键的配对过程中是否起到一定的作用。主要的研究工作和研究结果包括：(1)将hBMP4前导肽与成熟肽片段克隆到分泌型表达载体质粒pPIC9K多克隆位点上，构建能表达hBMP4前导肽与成熟肽的重组质粒pPIC9K-hBMP4/pro-ori；(2)以这一表达载体为基础，对hBMP4前导肽与成熟肽之间内源性蛋白水解酶识别位点进行定点突变，将真核细胞中碱性氨基酸蛋白酶(furin)识别的位点(RXXR)改为酵母细胞中丝氨酸蛋白酶(Kex2P)识别的位点Kex2，并以此构建了重组质粒pPIC9K-hBMP4/pro-mut;(3)表达质粒经转化酵母宿主菌株GS115，PCR鉴定基因整合后，摇瓶培养，甲醇诱导表达并用点杂交来快速筛选高表达菌株。表达产物经SDS-PAGE和Westernblotting分析表明表达产物具有良好的抗原性和特异性，内源性蛋白水解酶识别位点的改造能够使前导肽有效切割，切割后BMP4成熟肽的分子量为22KD，与标准蛋白一致，但不存在同二聚体形式的产物。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写

内容提要

第一部分文献综述

1 BMPs概述

1.1 BMPs的结构特点及分类

1.2 BMPs的理化特征及基因定位

1.3 BMPs的受体及信号转导机制

1.4 BMPs的诱骨活性

1.5 BMPs的重组表达研究

2毕赤酵母真核表达系统及影响表达的因素

2.1外源基因对Pichiapastoris表达外源蛋白的影响

2.2宿主菌

2.3表达载体

2.4表达产物糖基化

3分子内分子伴侣及其辅助蛋白质折叠的机制

3.1分子内分子伴侣的概念和分类

3.2分子内分子伴侣的结构特点

3.3分子内分子伴侣介导的蛋白质折叠的特点和机制

第二部分表达载体pPIC9K-hBMP4/pro-ori和pPIC9K-hBMP4/pro-mut的构建

1.实验材料

1.1菌株与质粒

1.2工具酶

1.3生化试剂

1.4主要仪器

2.方法及步骤

2.1表达质粒pPIC9K-hBMP4/pro-ori的构建

2.2表达质粒pPIC9K-hBMP4/pro-mut的构建

3结果

3.1表达质粒pPIC9K-hBMP4/pro-ori的构建

3.2表达质粒pPIC9K-hBMP4/pro-mut的构建

第三部分重组质粒pPIC9K-hBMP4/pro-ori、pPIC9K-hBMP4/pro-mut及pPIC9K-hBMP4在毕赤酵母中的表达及鉴定

1实验材料

1.1菌株与质粒

1.2工具酶

1.3生化试剂

1.4主要仪器

1.5培养基及有关溶液的配制

2实验步骤及方法

2.1 pPIC9K-hBMP4/pro-ori在毕赤酵母中的表达

2.2pPIC9K-hBMP4/pro-mut在毕赤酵母中的表达

2.3pPIC9K-hBMP4在毕赤酵母中的表达

3实验结果

3.1质粒线性化

3.2酵母转化子的筛选及鉴定

3.3小量摇瓶表达筛选高表达菌株

3.4表达上清的Western Bloting分析

附图

第四部分小结与讨论

1小结

1.1表达质粒pPIC9K-hBMP4/pro-ori的构建

1.2表达质粒pPIC9K-hBMP4/pro-mut的构建

1.3重组质粒pPIC9K-hBMP4/pro-ori和pPIC9K-hBMP4/pro-mut在毕赤酵母中的表达

2讨论

2.1关于表达系统和表达载体的选择

2.2关于表达载体的构建

2.3表达产物的分析

参考文献