转染Noggin基因的骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞的初步研究

摘要

[目的] 脑卒中是神经系统的常见病、多发病，其致残率和病死率均很高。脑卒中治疗的关键是重建神经通路，重建神经通路的前提是有新生神经细胞的发生。成年哺乳动物脑内神经干细胞的发现，给脑卒中的治疗带来了新的曙光。但神经干细胞的组织来源一直是这一研究领域最棘手的问题。 骨髓基质细胞(bone marrow stromal celIs,BMSC)，是存在于骨髓基质中一种成体干细胞，来源于中胚层，具有很强的自我增殖和多向分化能力，可以分化为多种不同的组织细胞，是组织工程学研究中的一种理想种子细胞。目前国内外研究报道骨髓基质细胞在体内外可被诱导分化神经细胞，如骨髓基质细胞可以被化学物质如视黄酸、β-巯基乙醇，中药如黄芩甙、天麻等诱导分化为神经细胞。但是利用胚胎发育过程中的神经诱导蛋白--Noggin蛋白对骨髓基质细胞诱导分化的研究在国内尚属空白。 Noggin基因是1992年California大学的Harland，R．M．和Smith，W．C．从非洲爪蟾的胚胎中分离出来的，在胚胎发育中有重要神经诱导作用，尤其是诱导外胚层的背侧发育<'[1]>。作为一种内源性神经诱导信号，它的作用不仅局限于胚胎期，在成年哺乳动物中枢神经系统也可检测到noggin基因的表达。另外它还参与其他组织的发育过程，如心脏中隔的形成和关节软骨的形成。 因此，本研究拟通过克隆并构建一个Noggin基因的表达载体，初步探讨转染Noggin基因的骨髓基质细胞在体外分化为神经细胞的情况，为下一步进行骨髓基质细胞的神经移植或基因治疗打下基础。 [方法] 1．用Percoll淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质细胞，并用含20％(体积分数)胎牛血清的DMEM培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质细胞。 2．应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术，从正常人胎脑组织中扩增出Noggin基因，利用基因工程技术将其与质粒pCS2+[Ta1]-GFP连接，构建载体pCS2+[Tαl]-Noggin。经酶切、PCR、DNA序列分析鉴定确定载体构建无误。 3．取第四代、第六代BMSC，用脂质体转染法介导Noggin基因进入到骨髓基质细胞内。观察细胞形态的改变，并利用免疫细胞化学技术鉴定分化细胞是否表达神经细胞特异性标记：物神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)以及星形胶质细胞特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。 [结果] 1．大鼠BMSC的分离培养用Percoll淋巴细胞分离液对大鼠骨髓作密度梯度离心，所得细胞为比较均一的球形单个核细胞，台盼兰染色细胞活力达99％。接种培养10-14天后，细胞贴满培养瓶瓶底，进行细胞的首次传代。传3-4代后，可以形成较典型的BMSC，细胞大而扁，呈梭形、三角形、多角形，折光性差，立体感不强。 2．从正常人胎脑组织中克隆出的noggin cDNA片段经测序鉴定，克隆基因序列与GenBank收录人noggin cDNA序列(基因存取号NM_005450)完全同源。并以此成功构建Noggin基因的真核表达载体pCS2+[Tα1]-Noggin。 3．BMSC转染带有Noggin基因的表达载体后，可以观察到胞体收缩，折光性增强，并伸出较长轴突和树突样突起，形态类似神经细胞；免疫细胞化学方法检测分化细胞表达NSE、MAP-2，未检测到GFAP表达。 [结论] 转染的Noggin基因的骨髓基质细胞在体外可以分化为神经元样细胞。

目录

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符号说明

总前言

大鼠骨髓基质细胞的分离培养

人Noggin基因克隆及真核表达载体构建

转染Noggin基因的骨髓基质细胞在体外分化为神经元样细胞的初步研究

总结论

附图

参考文献

致 谢

在攻读硕士学位期间期间发表文章目录