转染Brn2、Ascl1、Myt1l基因的BMSC在体外分化为神经元样细胞的初步研究

摘要

[目的]:
　　 脑卒中是神经系统的常见病、多发病，其致残率和病死率均很高。脑卒中治疗的关键是重建神经通路，重建神经通路的前提是有新生神经细胞的发生。成年哺乳动物脑内神经干细胞的发现，给脑卒中的治疗带来了新的曙光。但神经干细胞的组织来源一直是这一研究领域最棘手的问题。
　　 骨髓基质干细胞(bone marrow stroma1 cell，BMSC)，是存在于骨髓基质中一种成体干细胞，来源于中胚层，具有很强的自我增殖和多向分化能力，可以分化为多种不同的组织细胞，是组织工程学研究中的一种理想种子细胞。目前国内外研究报道骨髓基质干细胞在体内外可被诱导分化神经细胞，如骨髓基质干细胞可以被化学物质如视黄酸、β-巯基乙醇，中药如黄芩甙、天麻等诱导分化为神经细胞。但是利用转录因子Brn2、Asc11、Myt11基因对骨髓基质干细胞诱导分化的研究在国内尚属空白。
　　 Brn2又称为POU3F2，是POU转录因子家族之一，主要在中枢神经系统当中表达。有研究表明，Brn2可调节神经系统的基因表达，在哺乳动物的神经发生方面发挥着重要的作用。Asc11基因的编码产物是碱性螺旋-环-螺旋(BHLH)转录因子家族之一。Asc11在神经定型、分化，以及嗅觉与自主神经元的发生方面发挥着重要的作用。Myt11基因又称为Nzf1基因，可特异性结合于视黄酸反应原件，表现出转录活化作用。Myt11基因可能与神经系统与脑垂体的基因表达调控有关。
　　 因此，本研究拟通过克隆并构建一个含有Brn2、Asc11、Myt11基因的慢病毒表达载体，初步探讨转染Brn2、Asc11、Myt11基因的骨髓基质干细胞在体外分化为神经细胞的情况，为下一步进行骨髓基质干细胞的神经移植或基因治疗打下基础。
　　 [方法]:
　　 1.用Percol1淋巴细胞分离液分离出大鼠骨髓基质干细胞，并用含20％(体积分数)胎牛血清的DMEM培养液培养，胰酶消化传代，扩增大鼠骨髓基质干细胞。
　　 2.采用PCR技术克隆出长分别为696bp、1338bp及3558bp的Brn2、Asc11、Myt11基因部分序列，利用Gateway克隆技术构建pLV.EX3d.nu1l-CMV＞mAsc11/E2A/mBrn2/F2A/mMyt11质粒。经酶切、PCR、DNA序列分析鉴定确定载体构建无误。
　　 3.取第四代、第六代BMSC，用慢病毒转染法介导Brn2、Asc11、Myt11基因进入到骨髓基质干细胞内。观察细胞形态的改变。
　　 [结果1:
　　 1.大鼠BMSC的分离培养用Perco11淋巴细胞分离液对大鼠骨髓作密度梯度离心，所得细胞为比较均一的球形单个核细胞，台盼兰染色细胞活力达99％。接种培养10-14天后，细胞贴满培养瓶瓶底，进行细胞的首次传代。传3-4代后，可以形成较典型的BMSC，细胞大而扁，呈梭形、三角形、多角形，折光性差，立体感不强。
　　 2.Brn2、Asc11、Myt11基因片段经测序鉴定，克隆基因序列与GenBank收录小鼠Brn2(NC_000070.5)、Asc11(NC_000076.5)、Myt11(NC_000078.5)完全同源。并以此成功构建Brn2、Asc11、Myt11基因的真核表达载体pLV.EX3d.nu11-CMV＞mAsc11/E2A/mBrn2/F2A/mMyt11。
　　 3.BMSC转染带有Brn2、Asc11、Myt11基因的表达载体后，可以观察到胞体收缩，折光性增强，并伸出较长轴突和树突样突起，形态类似神经细胞。
　　 [结论]:转染的Brn2、Asc11、Myt11基因的骨髓基质干细胞在体外可以分化为神经元样细胞。