转盐芥ZEP基因提高烟草和沾化冬枣耐逆性的研究

摘要

脱落酸(abscisic acid，ABA)不仅在植物休眠、衰老和果实发育等过程中起着重要作用，而且还在植物的逆境适应中起着重要的调节作用，是植物体内重要的逆境响应激素。本实验室从盐芥中克隆了ABA合成途径中关键酶基因玉米黄素环氧化酶(zeaxanthin epoxidase，ZEP)基因，该基因催化来源于C<,40>-类胡萝卜素的玉米黄素经过两次环氧化形成紫黄质。随后利用DNA重组技术构建了植物表达载体并转化烟草。在此基础上，本论文研究了转正、反义ThZEP基因烟草植株的性状变化，并将正、反义ThZEP基因转入沾化冬枣植株中，希望在此基础上进一步研究ABA对沾化冬枣抗逆性和生长发育的影响。 在对T<,o>代转基因烟草的PCR检测基础上，对正义转基因烟草分别进行了Southern blot，结果显示绝大多数PCR检测阳性植株杂交结果为阳性，表明外源基因已整合到烟草基因组中。对Southern blot阳性的部分株系进行Northem blot分析，证明在部分株系中外源基因已经表达。 在干旱胁迫条件下，脱落酸能够通过阻止气孔开放和诱导气孔关闭而减少水分的散失。聚乙二醇可以模拟干旱胁迫条件，从而调控植株ABA的合成以响应环境的改变。离体条件下对转基因烟草植株的叶片进行10％PEG6000胁迫处理2小时后，在检测的10个株系中，除转正义ThZEP基因的株系+1外其它株系的气孔开度与对照植株相比差异不明显。将转正、反义基因烟草与对照植株进行整株的PEG6000胁迫处理，在用18％的PEG6000处理4小时后，转反义基因植株和对照植株出现严重的叶片萎蔫症状，而转正义基因植株叶片基本未发生萎蔫；转反义基因烟草和对照植株在16％的PEG6000浓度处理4小时后，转反义基因的植株烟草先于对照植株出现叶片萎蔫症状。采用HPLC法对经胁迫处理的不同转基因株系的叶片进行ABA含量测定，转正义ThZEP基因的叶片ABA含量明显高于对照植株叶片的，而转反义ThZEP基因的叶片中ABA的含量比对照植株叶片低。 在对转基因烟草植株后代的T<,I>代种子的萌发率进行分析后发现，转正义ThZEP基因的烟草植株种子与对照植株相比要延迟萌发，其中株系+46的种子在大约10天后才萌发，比对照萌发时间延迟了5天。转反义基因烟草株系的T<,I>代种子有提前萌发的趋势，其中株系-19的种子萌发速度最快。 本论文还以沾化冬枣无菌小苗的裸露茎尖为受体，采用农杆菌介导法进行遗传转化。以除草剂筛选三代后成活的抗性小苗为材料，恢复培养后，取其新生叶片，微量提取DNA分别进行了PCR和PCR-Southern检测。检测结果表明，获得了转基因的沾化冬枣植株，转化频率分别为转正义ThZEP基因的阳性率为3.13％，转反义ThZEP基因的阳性率为2.75％。为排除农杆菌污染对PCR检测结果的干扰，本试验根据pCAMBIAl300-als质粒中非T-DNA区序列设计特异性引物，以初步检测目的基因为阳性的植株DNA为模板进行再一次的扩增检测。扩增结果显示，部分植株为阳性，这表明可能存在农杆菌的污染，转正义基因植株的农杆菌污染比例25％，转反义基因植株的农杆菌污染比例为27．2％。

目录

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摘要

缩略词表

1前言

2.材料与方法

3结果与分析

4讨论

参考文献

致谢