茶多酚抑制ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤的机制研究

摘要

目的：茶多酚(Tea Polyphenols，TP)是从茶叶中提取的多酚类物质，是茶叶中的主要活性成分。大量的实验研究表明茶多酚是一种天然抗氧化剂，具有较强的抗氧化性。低密度脂蛋白(LOW density lipoprotein，LDL)在体内外都可被氧化修饰成氧化型LDL(Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)，研究表明ox-LDL具有细胞毒性作用，且能促进泡沫细胞形成，认为是动脉粥样硬化发生的始动因子。体内外研究都发现ox-LDL的氧化应激作用所致的内皮细胞损伤是其细胞毒性的主要体现形式之一。本实验将铜离子诱导LDL氧化修饰的ox-LDL作用于人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells．HuVEC)，观察了OX-IDL对HUVEC的生长抑制作用，并通过在蛋白质水平和mRNA水平微管骨架蛋白和凋亡相关蛋白的检测和分析，探讨OX-LDL促进动脉粥样硬化发生的机制，试图寻找有效降低动脉粥样硬化发生率的干预措施，并为茶多酚的进一步广泛应用提供科学依据。 方法首先采用铜离子诱导法将LDL氧化修饰为ox-LDL。复苏后HUVEC置于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。将处于对数生长期的HuVEC分为对照组和三个实验组：茶多酚组、ox-LDL+茶多酚组、ox-LDL组。茶多酚和ox-LDL在培养体系中的终浓度分别为251μg/ml和200μg/ml，对照组加入等体积的PBS。加入茶多酚和ox-LDL培养48h后，采用四唑盐(Methyl thiazolvltetrazolium，MTT)比色法测定细胞活性、吖啶橙荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化，DNA Ladder分析DNA断裂情况，分别采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)及Western blotting、免疫细胞化学方法分析凋亡相关蛋白Bcl-2、BaX和caspase-3以及微管蛋白α-tubulin和β-tubulin的表达。反转录聚合酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测bc1-2、Bax、caspase-3、α-tubulin和β-tubulin mRNA水平的改变。 结果 1．茶多酚和OX-LDL对细胞生长的影响 HUVEC给予OX-LDL和/或茶多酚处理48h后，MTT法测定细胞增殖情况，结果显示，OX-LDL可明显抑制HUVEC的生长(40.0％，P<0.05)，加入茶多酚后则明显降低OX-LDL所致的细胞生长抑制(7.8％，P>0.05)。 2．茶多酚及OX-LDL对细胞形态的影响 将不同组细胞分别用吖啶橙荧光染色，荧光显微镜下观察对照组、茶多酚组细胞核呈圆形，结构完整，形态较规则。加入OX-LDL后，细胞变得不规则，细胞核可见浓染致密的颗粒块状荧光，聚集在细胞边缘，呈新月牙形排列，并可见荧光碎片。给予OX-LDL的同时给予茶多酚，细胞基本正常，其中偶见细胞核内呈新月牙形排列的荧光。 3．DNA Ladder结果 DNA Ladder结果观察Nox-LDL诱导内皮细胞出现“ladder”现象，提示HUVEC发生DNA断裂。同时给予茶多酚，“ladder”现象明显减弱，提示DNA断裂情况被抑制。 4．凋亡相关蛋白Bc1-2、Bax、caspase-3和微管蛋白α-mbulin和β-mbulin蛋白表达的检测 5.RT-PCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和微管蛋白α-tubulin和β-tubulin Mrna水平的变化 Ox-LDL和茶多酚对HUVEC Bcl-2、Bax和β-tubulin Mrna水平的影响与其对蛋白质水平的影响基本一致，但对caspase-3和α-tubulin Mrna作用却不同。 首先，ox-LDL显著降低了Bcl-2 Mrna水平(28％，P<0.01)，使Bax Mrna水平升高33％(P<0.01)。但是ox-LDL对caspase-3 Mrna的影响与对照组相比没有显著差异(P>0.05)。茶多酚与ox-LDL共同作用以后，Bcl-2 Mrna水平升高，Bax Mrna和caspase-3 Mrna水平降低都不明显(与ox-LDL组相比，P>0.05)。 其次，OX-LDL能显著降低HUVECβ-tubulin Mrna水平(27％，P<0.01)，茶多酚与OX-LDL共同作用以后，β-tubulinmRNA水平升高了14％(P<0.05)。无论OX-LDL还是茶多酚对仅α-tubulin Mrna水平的影响都没有显著性差异(P>0.05)。 结论 1.0x-LDL具有明显的细胞毒性，能引起HUVEC细胞骨架破坏，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡。 2.0x-LDL诱导细胞凋亡与Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达和Mrna水平改变有关。 3.0x-LDL的细胞毒性也表现为对微管蛋白仪α-tubulin和β-tubulin的影响，且在蛋白质水平改变要比在Mrna水平改变明显。 4.首次观察到茶多酚对OX-LDL诱导的HUVEC凋亡有抑制作用，可能是逆转了Bcl-2、Bax和caspase-3 Mrna和蛋白表达，抑制了DNA断裂，最终表现为细胞凋亡形态学特征消失。 5.首次观察到茶多酚对OX-LDL诱导的HUVEC微管蛋白α-tubulin和β-tubulin表达改变有逆转作用，从而维持了细胞的完整性。

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