促红细胞生成素在瑞氏木霉中的表达及糖基化初步研究

摘要

EPO全称促红细胞生成素 (erythropoietin)，是哺乳动物和其他高等真核生物中一种主要由肾脏细胞合成和分泌的糖蛋白，它的基本生理功能是促进骨髓红细胞的生成和释放，此外还具有保护神经细胞和视网膜细胞等作用，在临床上广泛应用于治疗由各种疾病引起的贫血症，具有巨大的药用价值。目前，EPO的生产主要依靠哺乳动物细胞蛋白表达系统，如CHO细胞系等，但成本昂贵，大大限制了其使用，需要开发新的生产系统。 瑞氏木霉(T．reesei)是自然界中广泛分布的腐生性丝状真菌，具有极好的合成蛋白和分泌蛋白的能力，某些高产菌株胞外纤维素酶的主要成分一外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ的产量可达20～40 g/L，此启动子为强启动子。瑞氏木霉作为微生物具有结构简单、生长迅速、操作简便的优点，同时作为低等真核生物，又具有真核基因表达机制和存在真核蛋白质翻译后修饰加工装置，具有与哺乳动物系统相似的蛋白修饰性能。近年来，瑞氏木霉已作为基因工程宿主菌用于生产外源真核蛋白。但对于真核糖蛋白，尤其是对于某些药用糖蛋白的活性和稳定性而言，糖基化的程度和糖基化正确与否至关重要。最近研究人员已开始对丝状真菌的糖基化途径进行改造，以期望得到能够产生与哺乳动物糖基化形式相近的工程菌株，以便应用于人源糖蛋白的生产。 在蛋白质表达的研究中，影响外源蛋白产量的因素包括启动子强度以及拷贝数、信号肽，蛋白质分离纯化步骤等。为构建人源促红细胞生成素在瑞氏木霉中的高效表达载体，本文利用本室在T．reesei cbh1强启动子基础上构建的4拷贝(每拷贝序列长200bp，含有CCAAT盒、转录激活因子Ace2结合位点、XlnR．结合位点)人工启动子，cbh1终止子和CBHI信号肽序列构建了分泌型的人源EPO表达载体pE。 将EPO表达载体pE质粒与携带有潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的pAN7-1质粒分别共转化T．reesei 蛋白酶缺陷型菌株Rut C30 U4和在Rut C30 U4基础上进一步经过初步糖基化改造，已经转入人源N-乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅰ基因的工程菌株T108，在含有150 mg/L潮霉素的基本培养基平板上各筛选得到78和150个潮霉素抗性转化子。分别挑取单菌落培养，经PCR验证，从两种转化子中分别挑选得到epo基因整合到染色体并且能稳定遗传的转化菌株T47和T112。在分子水平和蛋白水平对转化子T47和T112进行了验证。对两株转化子的Dot Blot分析结果表明epo基因已经整合到转化子染色体上。RT-PCR，SDS-PAGE和Western Blot杂交分析结果表明epo基因在T. reesei中已经转录和翻译，表明重组人源EPO蛋白在T reesei中成功表达。SDS-PAGE和Western Blot杂交分析结果显示菌株T112表达的重组EPO蛋白分子量(32.5KD)比T47表达的EPO蛋白(28KD)增大约4.5KD，说明带有N-乙酰氨基葡萄糖转移酶工基因的T112所表达的蛋白的糖基化程度有所提高。利用BandScan软件计算得出，T47所表达的促红细胞生成素产量约为97.3 mg/L，而T112所表达的促红细胞生成素的产量约为46.7 mg/L。 利用T reesei cbhl1.4kb长的4拷贝强启动子和1.5kb终止子序列作为同源序列，构建了分别在N-端和C-端带有6His-tag的人源EPO分泌型同源整合表达载体plten和pltec。将plten和pltec表达质粒分别与质粒pAN7-1共转化T.reeseiT108，在潮霉素选择培养基上各得到40和43个转化子，挑取单菌落传代培养，经PCR验证，分别得到epo基因整合到染色体上并且能稳定遗传的菌株N5和C10。对N5和C10转化子的进一步分子验证和重组蛋白分离纯化工作正在进行中。 本文对高效表达人源epo基因所需要的各种元件进行精心设计和选择，选择了经过糖基化修饰改造的菌株作为宿主，实现了人源促红细胞生成素在丝状真菌瑞氏木霉中的成功表达。本文工作为以T.reesei为宿主菌生产人源药用蛋白，发展瑞氏木霉为新的药用蛋白生产系统进行了初步探索和奠定了一定的基础。

目录

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摘 要

缩略词表

第一章 绪论

1.1促红细胞生成素(EPO)概述

1.1.1 EPO研究进展

1.1.2 EPO生理生化特性及结构

1.1.3 EPO的生理功能

1.1.4 EPO的应用前景

1.2丝状真菌蛋白表达系统

1.2.1丝状真菌表达载体

1.2.2丝状真菌转化方法

1.2.3丝状真菌转化标记的选择

1.2.4转化DNA的整合

1.3重组糖蛋白在瑞氏木霉中的表达

1.3.1蛋白表达系统的选择

1.3.2融合蛋白标签

1.3.3糖蛋白在瑞氏木霉中的糖基化类型

1.4本文主要研究内容

第二章人促红细胞生成素在瑞氏木霉中的表达

2.1材料和方法

2.1.1菌株和质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3培养基及培养条件

2.1.4重组DNA技术

2.1.5重组质粒pT-△4的构建

2.1.6重组质粒pE的构建

2.1.7 pE质粒转化T.reesei

2.1.8瑞氏木霉染色体DNA的提取与纯化

2.1.9转化子的PCR验证

2.1.1 0转化子的Dot Blot分析

2.1.11转化子的RT-PCR分析

2.1.12 T.reesei蛋白的SDS-PAGE

2.1.13 T.reesei蛋白的Western blot分析

2.2结果与讨论

2.2.1重组质粒pT-△4的构建

2.2.2表达载体pE的构建

2.2.3 T.reesei转化

2.2.4 PCR方法挑选T.reesei阳性转化子

2.2.5转化子的Dot Blot杂交分析

2.2.6转化子的RT-PCR验证

2.2.7 T.reesei转化子胞外蛋白的SDS-PAGE分析

2.2.8 T.reesei转化子胞外蛋白Western Blot分析

2.3本章小结

第三章带有his-tag的epo基因表达载体的构建及转化

3.1材料和方法

3.1.1菌株和质粒

3.1.2主要试剂

3.1.3培养基及培养条件

3.1.4重组DNA技术

3.1.5质粒plt4的构建

3.1.6 N-端带有his-tag的epo基因表达载体plten的构建

3.1.7 C-端带有his-tag的epo基因表达载体pltec的构建

3.1.8 plten和pltec质粒的T.reesei转化

3.1.9 T.reesei染色体的提取

3.1.10转化子的PCR验证

3.1.11融合蛋白的镍柱纯化方法

3.2结果与讨论

3.2.1质粒plt4的构建

3.2.2 N-端带有his-tag的epo基因表达载体plten的构建

3.2.3 C-端带有his-tag的epo基因表达载体pltec的构建

3.2.4 T.reesei转化

3.2.5 PCR方法挑选T.reesei阳性转化子

3.3本章小结

全文总结

参考文献

致 谢