内质网压力响应调节蛋白HAC1和分子伴侣HSP70在瑞氏木霉中的表达以及重组菌株糖基化模式检测

摘要

丝状真菌是一种新的极具希望的真核生物表达系统，它不仅具有微生物生长快速、操作简便等优点，还具有真核生物典型的翻译后修饰作用及强大的蛋白（主要为酶类）分泌能力，近年来，瑞氏木霉已作为基因工程宿主菌应用于外源真核蛋白的生产，但丝状真菌生产异源蛋白的表达水平远低于内源蛋白（每升发酵液数十克），达不到工业发酵规模的需求。本实验室前期工作已从多角度研究采取诸如增加基因拷贝数、利用强启动子表达等策略以提高外源蛋白的表达，并取得了一定的结果。本论文工作采用过表达非折叠蛋白响应（unfolded protein response，UPR）相关基因的办法进一步促进外源真核蛋白分泌量的提高。 非折叠蛋白响应（UPR）是调节蛋白加工分泌的重要机制，当过量表达异源蛋白时，多肽链不能及时正确折叠而滞留在内质网内，激活UPR途径，提高蛋白二硫键异构酶和分子伴侣等相关蛋白的表达量，促进内质网内滞留蛋白的重新折叠，从而增加蛋白的分泌量。 本文工作克隆了瑞氏木霉UPR调控基因hcal和分子伴侣hsp70基因，利用重组PCR技术将hacl基因表达盒PgpdA-hacl-TtrpC插入带有硫胺素抗性基因的自主复制质粒pME2892中，得到hacl表达载体pME-hac；利用相同方法将hsp70基因表达盒PtrpC-hsp-TtrpC插入到带有硫胺素抗性基因的表达载体T-ptrA中，得到hsp70单表达载体TptrA-hsp；再将其插入到pME-hac中，构建了携带有hac和hsp70基因双表达盒的载体pME-hachsp。 pME-hac、TptrA-hsp和pME-hachsp分别转化经过初步糖基化改造、同时表达促红细胞生成素（EPO）的重组菌株T．reesei 47和T．reesei 112，在含有适量抗硫胺素的再生基本培养基平板上筛选，以T．reesei 47为出发菌株分别得到20、9、4个硫胺素抗性转化子：以T．reesei 112为出发菌株分别得到10、12、5个硫胺素抗性的转化子。在含有抗硫胺素的基本培养基平板上进行复筛，分别挑取单菌落培养经PCR验证，从6种稳定遗传的转化子中分别挑选得到T47-hac、T47-hsp、T47-hachsp、T112-hac、T112-hsp和T112-hachsp转化菌株。 在分子水平和蛋白水平对转化子T47-hac、T47-hsp、T47-hachsp、T112-hac、T112-hsp和T112-hachsp进行了验证：southern Blot分析结果证实，hsp基因已经整合到转化子T47-hsp和T112-hsp的染色体上， hachsp双基因表达盒已经整合到转化子T47-hachsp的染色体上。SDS-PAGE检测显示，转化子T47-hsp的胞内总蛋白在约70KD处比出发菌株T47多1条蛋白带，这条带应该就是HSP70蛋白带，与预期大小相符，证明hsp70基因在T112-hsp中成功表达。 转化子T47-hsp和T112-hsp胞外蛋白总量及外切纤维二糖水解酶Ⅰ（CBHI）酶活力检测结果表明，过量表达基因hsp对瑞氏木霉胞外蛋白总量的提高没有显著影响，但对CBHI酶活力测定结果显示T47-hsp菌株的CBHI酶活力比出发菌株T47提高30％； T112-hsp的CBHI酶活力比出发菌株T112提高达80％。实验结果显示在丝状真菌中表达UPR途径相关基因能提高内源或外源蛋白的表达，这是提高工业菌株外源蛋白产量的一个有效的途径，对构建具有重要的经济价值的工业生产菌株有广泛的应用前景。 丝状真菌的蛋白质翻译后修饰系统与酵母相比，其N-糖基化类型更接近人源糖蛋白的寡聚糖类型，但仍然与哺乳动物存在着一定的差别。为使瑞氏木霉的糖基化修饰系统尽可能与人相同，必须进一步进行遗传改造。本实验室前期工作已经得到了两株对糖基化途径进行初步改造的瑞氏木霉重组菌株T108和GF4，但还没有对T108和GF4菌株糖蛋白的糖基化模式进行检测。本文利用阴离子交换层析柱和葡聚糖凝胶层析柱分离纯化了T108、GF4和出发菌株M23的糖蛋白CBHI。SDS-PAGE检测结果显示，T108和GF4的CBHI蛋白分子量都变小，证实T108中表达的N-乙酰葡萄糖氨基转移酶基因和GF4中敲除α-1，3-甘露糖基转移酶基因成功表达并改变了糖蛋白的糖基化修饰方式。用糖酰胺酶F酶解CBHI蛋白，释放糖链，进行了SDS-PAGE检测，切除糖链的蛋白和未切除糖链的蛋白在SDS-PAGE电泳上由于蛋白分子量变化而出现蛋白条带迁移，并产生40 KD左右大小的条带，推测该条带是被切除的糖类物质。 本实工作证实对瑞氏木霉进行的糖基化改造取得了初步的结果，为瑞氏木霉这一重要的工业菌株糖基化途径的进一步改造提供了实验数据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 绪论

1.1丝状真菌蛋白分泌途径

1.1.1内质网

1.1.2高尔基体

1.1.3质膜

1.1.4液泡

1.1.5内吞泡

1.2非折叠蛋白响应

1.2.1hacl/hacA基因

1.2.2分子伴侣hsp70基因

1.3糖蛋白在瑞氏木霉中的糖基化类型

1.3.1糖链在糖蛋白中的作用

1.3.2重组人源糖蛋白的生产

1.3.3糖蛋白在丝状真菌中的糖基化途径

1.4丝状真菌蛋白表达系统

1.4.1丝状真菌表达载体

1.4.2转化DNA的整合

1.4.3丝状真菌转化方法

1.4.4丝状真菌转化标记的选择

1.5本文主要研究内容

第二章内质网压力响应调节蛋白HAC1和分子伴侣HSP70在瑞氏木霉中的表达

2.1材料和方法

2.1.1菌株和质粒

2.1.2主要试剂

2.1.3培养基及培养条件

2.1.4重组DNA技术

2.1.5引物设计及PCR扩增条件

2.1.6表达载体pME-hac的构建

2.1.7表达载体TptrA-hsp的构建

2.1.8双表达载体pME-hachsp的构建

2.1.9瑞氏木霉T47和T112的转化

2.1.10瑞氏木霉染色体DNA的提取与纯化

2.1.11转化子的PCR验证

2.1.12转化子的SouthernBlot分析

2.1.13转化子蛋白总量及纤维素酶活的测定

2.1.14 T.reesei胞内蛋白的SDS-PAGE

2.1.15 T.reesei蛋白的Western blot分析

2.2结果与讨论

2.2.1表达载体pME-hac的构建

2.2.2表达载体TptrA-hsp的构建

2.2.3双表达载体pME-hachsp的构建

2.2.4 T.reesei转化

2.2.5 PCR方法挑选T.reesei阳性转化子

2.2.6转化子的Southem-Blot杂交分析

2.2.7 T.reesei转化子胞内蛋白的SDS-PAGE分析

2.2.8转化子胞外蛋白总量及纤维素酶活的测定

2.2.9 T.reesei转化子EPO Western Blot分析

2.3本章小结

第三章糖基化途径改造菌株的糖基化分析

3.1材料和方法

3.1.1实验流程

3.1.2菌株和质粒

3.1.3主要试剂和仪器

3.1.4培养基及培养条件

3.1.5样品的收集和处理

3.1.6阴离子交换层析介质的处理及装柱

3.1.7葡聚糖凝胶层析介质的处理及装柱

3.1.8绘制对硝基酚标准曲线

3.1.9纤维二糖水解酶酶活力测定

3.1.10阴离子交换层析分离纤维二糖水解酶

3.1.11葡聚糖凝胶层析柱分离纤维二糖水解酶

3.1.12糖链的释放

3.1.13糖链检测方法

3.2结果与讨论

3.2.1阴离子交换层析柱分离CBHI

3.2.2葡聚糖凝胶层析柱G-100分离纤维二糖水解酶

3.2.3 CBHI分离纯化及糖酰胺酶-F酶切结果

3.3本章小结

全文总结

参考文献

致 谢