羟基脯氨酸小分子类肽化合物对Ⅳ型胶原酶活性作用筛选及LY52抗肿瘤转移作用研究

摘要

研究背景与目的： 肿瘤侵袭与转移是指癌细胞脱离原发部位，侵入新环境并生长的过程。主要包括：1.癌细胞穿过基底膜；2.侵入原发部位血管、淋巴管；3.侵入继发部位并降解和穿透基底膜；4.在继发部位生长。基质金属蛋白酶《matrix metalloproteinases，MMPs)降解基底膜对上述过程起核心作用。在已经发现的28种MMPs中，根据其底物不同，分为4类，胶原酶、明胶酶(Ⅳ型胶原酶)、间质溶解素和基质溶解素。其中，肿瘤细胞高表达Ⅳ型胶原酶(MMP-2,-9)并降解基底膜是肿瘤浸润与转移的关键步骤，Ⅳ型胶原酶成为研究肿瘤转移的核心酶，以该酶为靶点设计化合物是抗转移药物研究的热门课题。富含羟基脯氨酸的胶原蛋白是MMP-2,-9的天然底物，羟基脯氨酸可能是MMP-2,-9的主要识别位点，设计含有羟基脯氨酸骨架的化合物可能较大程度地提高对MMP-2结合选择性。以x线衍射技术分析MMPs的3-D结构，发现MMP-2,-9活性结合腔(active S’<,1> pocket ofmatrix metaUoproteinase)具有比MMP-3更狭长的特点。因此，徐文方等分析参比化合物CGS27023A：和Bestatin等化学结构特点后，设计合成了以结构细长，柔性较高为特点的多个系列羟基脯氨酸小分子类肽化合物用于对Ⅳ型胶原酶抑制活性的筛选和抗肿瘤转移实验，包括N1-取代咖啡酰吡咯烷小分子类肽化合物和N1-取代没食子酰吡咯烷化合物；N1-乙酰基取代吡咯烷类化合物和环亚胺类肽化合物等。本项研究以Ⅳ型胶原酶为靶点，在筛选活性化合物基础上，对N1-取代咖啡酰吡咯烷小分子类肽化合物LY52进行了重点研究。 实验方法：化合物的活性筛选实验，以琥珀酰明胶降解法检测化合物对人Ⅳ型胶原酶活性抑制作用；以MTT法检测化合物对人卵巢上皮癌细胞SKOV3生长的影响，评价其对细胞的作用性质；以SDS-FAGE明胶酶谱分析SKOV3细胞培养上清液MMP-2,-9水平，评价化合物对酶活性的影响。研究N1-取代咖啡酰吡咯烷小分子类肽化合物LY52抗肿瘤侵袭与转移作用，实验分五部分： 1.观察化合物对肿瘤细胞生长抑制作用：以MTT法分别观察对SKOV3和人乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制作用； 以细胞克隆生长实验法，观察较长接触时间，化合物对肿瘤细胞生长的影响；以台盼蓝染色方法，检查化合物处理细胞蓝染细胞比例，评价化合物对肿瘤纽胞抑制作用性质。 2.评价化合物对SKOV3和MDA-MB-231细胞表达MMP-2和：MMP-9活性的抑制作用：以CoA刺激MDA-MB-231细胞膜表面pro-MMP-2活性转化，SDS-PAGE分析培养上清液中MMP-2水平；以Western blotting和免疫组织化学法等分别检测体外培养和裸鼠体内生长的人肿瘤细胞表达MMP-2,-9水平。 3.观察化合物抑制肿瘤细胞黏附作用：以MTT法评价肿瘤细胞与基底膜蛋白的黏附能力：免疫荧光流式细胞仪测定肿瘤细胞表面黏附分子CD44表达水平。 4.LY52抑制肿瘤细胞侵袭与转移实验：以transweU chamber方法观察LY52抑制人SKOV3和MDA-MB-231细胞穿过人工基底膜的能力；分别以C57BL/BL6小鼠尾静脉注射B16-F10细胞法和Lewis肺癌细胞转移模型，评价LY52对体内生长肿瘤细胞侵袭与转移的抑制作甩。 5.观察化合物抑制肿瘤微血管形成作用：以Westernblotting法测定肿瘤细胞VEGF，TGF-α，bFGF表达水平；以免疫组织化学方法检查裸鼠接种人肿瘤组织CD34表达，评价肿瘤微血管密度(MVD)；将LY52与鸡胚尿囊膜(CAM)接触，观察其对微血管生成的抑制作用。 结果： 羟基脯氨酸小分子类肽化合物对SKOV3细胞仅产生较弱的生长抑制作用，直接与细胞接触120 h，剂量100μg/ml以下时，大多数化合物对肿瘤细胞生长抑制率低于10％；500-1000 μg/ml，最高抑制率15-50％。琥珀酰明胶降解法检测化合物对Ⅳ型胶原酶活性的影响，多数化合物具有程度不等对Ⅳ型胶原酶活性抑制作用。SDS-PAGE酶谱分析法检测化合物对SKOV3细胞培养液。MMP-2和MMP-9活性影响，从N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物中筛选出了编号为LY52、No21和No26；环亚胺类肽化合物中编号为11i，11r,Pro-B，9+HNE62，16A，N04，DBC，5+Ala，11a，11u；N1-乙酰基取代吡咯烷类肽化合物中编号为A18，A11，A13，A2等具有抑制MMP-2和：MMP-9活性作用，其中LY52和11i的活性最强。另外，还从N1-乙酰基取代吡咯烷类化合物中筛选出A3和A5可能具有促进MMP-2和MMP-9降解明胶作用。 对N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物LY52进行了重点研究，与细胞直接接触，LY52对人卵巢癌细胞SKOV3和人乳腺癌细胞MDA-MB-231仅具有较弱的生长抑制作用。以100 mg/kg口服给药，对S180小鼠肉瘤有一定的抑制作用，对小鼠体重没有明显影响。化合物与明胶酶孵育，LY52具有直接抑制明胶酶降解明胶活性；与肿瘤细胞直接接触，以SDS-PAGE酶谱分析法发现LY52明显抑制SKOV3细胞培养液中MMP-2,-9对明胶的降解作用，说明抑制酶活性；进一步实验表明，LY52能够抑制CoA对MDA-MB-231细胞膜表面pro-MMP-2的活化作用，说明LY52可能的作用位点是阻止pro-MMP-2向active-MMP-2转化。与SKOV3细胞孵育12 h，Western MoRmg和免疫细胞化学法发现该化合物对细胞表达MMP-2,-9抑制作用弱，而对MDA-MB-231细胞表达active-MMP-2水平有较强的抑制作用。与肿瘤细胞孵育，LY52阻止肿瘤细胞与基底膜蛋白的黏附能力，并具有较弱降低肿瘤细胞CD44表达水平作用。与LY52直接接触12 h，SKOV3和MDA-MB-231细胞穿过人工基底膜的数量下降，显示具有抑制细胞侵袭与游走的能力。以小鼠Lewis肺癌和B16-F10黑色素瘤肺转移实验，口服给药3周，100 mg/kg和25 mg/kg剂量均能降低小鼠肺表面转移灶数量，证实LY52具有抑制动物肿瘤自发肺转移和人工肺转移作用。在微盘管形成方面，LY52降低肿瘤细胞微血管生长因子TGF-α和bFGF的表达水平，抑制裸鼠体内生长的肿瘤细胞VEGF表达；也能降低肿瘤组织血管内皮细胞CD34表达，显示降低肿瘤微血管密度(MVD)，可能与LY52抑制CAM血管生成有关系。 结论：以SDS-PAGE酶谱分析法，分别筛选出了N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物LY52、N021和N026，环亚胺类肽化合物11i，11r，Pro-B，9+HNE62，16A，No4，DBC，5+Ala，11a，11u和N1-乙酰基取代吡咯烷类肽化合物A18，A11，A13，A2等具有抑制MMP-2和MMP-9活性作用。另外，N1-乙酰基取代吡咯烷化合物A3和A5可能具有刺激MMP-2和MMP-9降解明胶的作用。LY52抑制癌细胞MMP-2,-9活性，降解基底膜能力下降，这可能与其阻止pro-MMP-2活性转化机制有关。LY52导致癌细胞与基底膜(BM)蛋白黏附性降低，细胞游走能力减弱，穿过人工基底膜能力下降。Lewis肺癌和B16-F10黑色素瘤细胞肺转移实验进一步证实了LY52的活性作用。

目录

论文说明：符号说明

声明

研究背景

第一部分：羟基脯氨酸小分子类肽化合物对Ⅳ型胶原酶活性筛选实验

材料和方法

1.实验材料

2.实验方法

3.统计学方法

结果

1.对明胶酶(Ⅳ型胶原酶)活性的影响：

2.化合物对SKOV3细胞生长抑制作用：

3.化合物对SKOV3细胞MMP-2和MMP-9活性影响：

讨论

结论

参考文献

第二部分：N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物-LY52抗肿瘤转移作用研究

材料和方法

1.实验材料

2.实验方法

结果

1.LY52抑制肿瘤细胞生长作用

2.LY52对明胶酶(Ⅵ型胶原酶)活性抑制作用

3.LY52对人癌细胞MMP-2，MMP-9表达抑制作用

4.LY52抑制肿瘤细胞黏附作用

5.LY52抑制肿瘤细胞侵袭和转移

6.LY52抑制肿瘤微血管形成

讨论

结论

参考文献

致谢

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