促生长激素神经肽在感觉和交感神经节的表达及有关的痛觉调节机制

摘要

促生长激素神经肽(galanin，Gal)是一个由29/30个氨基酸(在大多数物种为29个氨基酸，在人为30个氨基酸)组成的神经肽，在神经系统有广泛的表达，可发挥调节伤害性刺激、神经元发育和神经营养等多种生物学功能。在周围感觉神经节神经元和交感神经节(sympathetic ganglion，SG)神经元都检测到Gal的表达。Gal在周围神经系统对损伤的适应性反应及调节痛觉传递的过程中可能发挥作用。Gal被认为是背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)神经元损伤的标志物之一和交感神经元轴突受到严重损伤时神经元表型改变的一个标志。在正常成年动物，Gal在感觉神经元和SG神经元表达的水平很低；在周围神经损伤和炎症状态下，Gal的表达显著上调。 外周去甲肾上腺素能系统与痛觉的调节有一定的关系。正常健康状态下，去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)对痛觉的影响作用极小，在神经损伤或炎症时，去甲肾上腺素能系统发生的各种可塑性变化可影响其对抗伤害性刺激的效能。不同的α-受体的亚型在交感神经元有表达，这些受体激活后可影响交感神经系统的活性或神经递质的表达或释放，并最终导致不同的效应。 感觉神经肽和VR1的表达反映了DRG神经元感受伤害性刺激的特性。在初级传入神经元表达的感觉神经肽P物质(substance P,SP)在介导伤害性刺激的过程中发挥作用，Gal和SP可在同一个DRG感觉神经元中共存。外源性的Gal是否能影响DRG神经元VR1以及SP的表达尚需要进一步证实。 本研究建立了DRG神经元和颈上神经节(superior cervical ganglion，SCG)神经元培养模型，用这两个培养模型，分别研究了NE、CAP、NGF对DRG神经元Gal的表达的影响作用，NGF、6-OHDA、α-受体激动剂对SCG神经元Gal表达的影响作用。用动物实验探讨了Gal在福尔马林诱发的伤害性刺激中的作用及其机制。此外，NGF所致的DRG和SCG神经元轴突再生与Gal表达的关系，CAP对DRG神经元GalR2表达的影响，外源性Gal对DRG神经元SP释放、VR1表达的影响作用在本实验中也进行了探讨。 DRG取自胚胎15 d的Wistar大鼠，SCG神经元取自新生Wistar大鼠。DRG神经元和SCG神经元培养24 h后，再用阿糖胞苷(cytarabine，ara-C)作用24h抑制非神经元细胞生长。之后，用不同的处理因素作用4 d或正常培养4 d后用不同的处理因素作用4 h后进行检测。 (1)NE及α-受体拮抗剂孵育DRG神经元：DRG神经元用NE(10-4 mol/L)孵育4 d，或在加入NE之前10 min，在培养液内预先加入α1-受体拮抗剂哌唑嗪(10-6mol/L)或α2-受体拮抗剂育亨宾(10-5mol/L)。检测对Gal及其mRNA的表达。 (2)NGF孵育DRG神经元：DRG神经元用NGF(10 ng/ml)或NGF(10ng/ml)加NE(10-4 mol/L)孵育4 d，检测Gal及其mRNA的表达及单个神经元的轴突总长度。 (3)CAP孵育DRG神经元：①DRG神经元用不同浓度的CAP(10-8mol/L，10-7 mol/L,10 -6 mol/L)孵育4 h，检测Gal和GalR2及其mRNA的表达；②DRG神经元用不同浓度的CAP(10-8mol/L，10-7mol/L，10-6 mol/L)孵育4 d，检测Gal和GalR2及其mRNA的表达。 (4)外源性Gal孵育DRG神经元：DRG神经元用不同浓度的Gal(10-9mol/L，10-8mol/L, 10-7mol/L)孵育4 d，检测VR1及其mRNA、SPmRNA的表达及SP的释放。在加入Gal之前10 min，预先加入GalR拮抗剂M35(10-8 mol/L)或PKC抑制剂CalphostinC(10-7mol/L)，检测GalR拮抗剂及PKC抑制剂对Gal作用的影响。 (5)选择性α-受体激动剂孵育SCG神经元：SCG神经元分别用α-受体激动剂苯肾上腺素(10-5mol/L)和α2-受体激动剂可乐定(10-5mol/L)孵育4 d，检测Gal及其mRNA的表达。 (6)NGF或/和6-OHDA孵育SCG神经元：SCG神经元用NGF(10 ng/ml)、6-OHDA(10-5mol/L)、NGF(10 ng/ml)加6-OHDA(10-5mol/L)孵育4 d，检测Gal及其mRNA的表达及单个神经元的轴突总长度。 动物实验所用动物为体重为220-250g的雄性Wistar大鼠。随机分为5组，每组10只动物。Gal组、福尔马林组、福尔马林+Gal组、福尔马林+Gal+GalR拮抗剂组、福尔马林+Gal+PKC抑制剂组。在大鼠左侧后足底注射20μl2％的福尔马林诱发炎症，同时注射20μlGal(0.1 ng/μl)，之后进行缩足反射行为学检测实验。GalR拮抗剂(M35)在注射Gal前20 min、PKC抑制剂(CalphostinC)在注射Gal前60 min注射。Gal组、福尔马林组分别只注射20 μl Gal(0.1ng/μl)或20 μl 2％的福尔马林。行为学检测后，取左侧腰骶部DRG和腰骶部SG，检测Gal及其mRNA的表达。 本研究的结果显示：(1)用NE(10-4 mol/L)孵育4 d后，培养的DRG神经元中Gal及其mRNA的表达增加；用α1-受体阻断剂哌唑嗪(10-6 mol/L)预处理可阻断NE的这一效应；用α2-受体阻断剂育亨宾(10-5mol/L)预处理则不影响NE引起的Gal及其mRNA的表达增加。(2)用NGF(10 ng/ml)孵育4 d后，培养的DRG神经元中Gal及其mRNA的表达降低；NGF还可抑制NE诱发的Gal及其mRNA表达。NGF能促进DRG神经元轴突再生，而NE则不能促进DRG神经元轴突再生。(3)CAP(10-6mol/L)急性处理(4 h)或CAP(10-8mol/L，10-7mol/L)长期孵育(4 d)均可促进Gal及其mRNA的表达，CAP(10-7mol/L)长期孵育(4 d)可促进GalR2及其mRNA的表达。(4)外源性Gal可增加DRG神经元CAP诱发的SP释放量，但不影响SP及其mRNA的表达以及基础SP释放量。外源性Gal可促进DRG神经元VR1及其mRNA的表达，并呈剂量依赖方式。外源性Gal所致的DRG神经元VR1表达增加可部分地被GalR拮抗剂M35或PKC抑制剂Calphostin C所抑制。(5)α2-受体激动剂可乐定(10-5mol/L)可抑制SCG神经元Gal及其mRNA的表达，α1-受体激动剂苯肾上腺素(10-5mol/L)对SCG神经元Gal及其mRNA的表达无影响。(6)NGF(10 ng/ml)可抑制SCG神经元Gal及其mRNA的表达；6-OHDA(10-5mol/L)孵育SCG神经元，可促进Gal及其mRNA的表达；联合应用NGF和6-OHDA，NGF不能抑制6-OHDA引起的Gal及其mRNA表达的上调，但NGF能促进SCG神经元轴突再生。(7)注射福尔马林可诱发大鼠自发性疼痛行为缩足反射，注射20 μl Gal(0.1 ng/μl)可增加缩足反射的次数。在注射Gal前注射30μl(20 ng/μl)Gal受体拮抗剂M35或30μl PKC抑制剂Calphostin C(0.1ng/μl)，可部分抑制Gal引起的疼痛增强效应。(8)大鼠足底内注射福尔马林可引起同侧腰骶部DRG内Gal mRNA表达增加，神经肽Gal的表达无变化。腰骶部SG内Gal及其mRNA表达均无变化。这些结果表明：(1)DRG神经元内Gal的表达可受NE、NGF、CAP等多种因素的影响。NE通过作用于α1-受体，而不是α2-受体，增强了DRG神经元Gal的表达，这可能是外周促进伤害性刺激的肾上腺素能调节机制之一。NGF抑制DRG神经元内Gal的表达，一定孵育时间和孵育浓度的CAP刺激DRG神经元，Gal及其受体GalR2表达上调。这反映了Gal所介导的伤害性刺激作用机制的复杂性。 (2)SCG神经元内Gal的表达可受α2-受体激动剂、NGF、6-OHDA等多种因素的影响。交感神经元α2-受体的激活对Gal的表达有抑制作用，表明α2-受体可能参与了Gal介导的损伤刺激或炎症反应。外源性NGF可使培养的SCG神经元Gal表达下调，而6-OHDA则可使Gal表达上调。 (3)Gal可能介入了与VR1有关的伤害性刺激调节机制，GalR的活化和PKC通路被激活可能是其作用机制。Gal对福尔马林诱发的炎性疼痛的增强作用可能是由于Gal作用于GalR后激活了PKC细胞信号转导通路所致。选择性GalR拮抗剂和PKC抑制剂可能对炎性疼痛的治疗具有一定的应用价值。

目录

论文说明：符号及缩略语

声明

主要试剂及来源

主要仪器设备

前言

材料和方法

结果

1 NE对DRG神经元Gal及其mRNA表达的影响作用

2 选择性α-受体汽激动剂对SCG神经元Gal及其mRNA表达的影响作用

3 NGF对DRG神经元Gal及其mRNA表达的影响作用

4 NGF对DRG神经元轴突生长的影响作用

5 NGF或/和6-OHDA对SCG神经元Gal及其mRNA表达的影响作用

6 NGF或/和6-OHDA对SCG神经元轴突生长的影响作用

7 CAP对DRG神经元Gal及其mRNA表达的影响作用

8 CAP对DRG神经元GaIR2及其mRNA表达的影响作用

9 外源性Gal对DRG神经元VR1及其mRNA表达的影响作用42-43

10 外源性Gal对DRG神经元SP表达及其释放的影响作用

11 GalR拮抗剂和PKC抑制剂对外源性Gal所致的VR1表达变化的影响作用

12 Gal对福尔马林诱发疼痛的行为学影响

13 福尔马林诱发的炎症对DRG和SG神经元Gal及其mRNA表达的影响作用

讨论

结论

参考文献

外周去甲肾上腺素能系统对痛觉的调节作用及其机制

攻读学位期间发表的学术论文以及参与承担的科研课题

致谢