8-羟基喹啉及其类似物抑制体外H460细胞增殖的机理研究

摘要

铜是人和动物组织必需的微量元素之一，也是细胞调整蛋白骨架必需的化学元素。多项癌症研究发现，血清中铜的浓度与肿瘤发生，肿瘤负荷，肿瘤恶性进展及肿瘤复发有关。铜在肿瘤发生过程中发挥着积极的作用，肿瘤细胞的特性之一是积聚高浓度铜，有目的的消耗铜是目前研究者认为比较理想的抗肿瘤策略之一。目前一些上市的抗铜试剂比如四硫钼酸盐Tetrathiomolybdate（TM）、卡托普利（Captori1）、锌（Zinc）和曲恩汀（Trientine）等被发现在抗肿瘤治疗中有一定功效，它们的作用主要是降低肿瘤组织中过量的铜，但是它们的最大局限性表现为疗期过长、副作用高、毒性大等。 8-羟基喹啉8-hydroxyquinoline（Ox）和5-氯-7-碘-8-羟基喹啉5-chloro-7-iodo-8-hydroxyquinoline（CQ）是一类常见的金属配合物。有资料证实CQ与Cu（Ⅱ）形成的复合物可能依赖于8位羟基和吡啶环上的N。近几年有研究发现CQ不但可以有效的治疗老年痴呆症还可以抑制8种不同的人体肿瘤细胞系的生长，而且这个抑制作用会随着金属离子Cu2+或者Zn2+的介入而增强。有研究还表明Cu2+存在的条件下，Ox和CQ是一类新型的蛋白酶体抑制剂。但是Ox及其CQ在CU2+存在的条件下对肿瘤细胞的作用机制目前还不清楚。 基于以上研究，本论文将着重探讨Ox、CQ在内源性铜的介入下抑制H460肺癌细胞增殖的作用机制。论文将围绕三个部分展开研究：第一部分研究Ox、CQ对H460肺癌细胞生长的抑制作用，重点探讨Ox、CQ对铜的依赖性与其抗肿瘤活性的关系；第二部分通过将Ox、CQ的8-位羟基进行取代得到70个Ox类似物，研究这些类似物的抗肿瘤活性是否依赖于铜；第三部分初步探讨Ox、CQ及其Ox类似物对H460细胞生长抑制作用的机理。 论文另一部分的主要工作是运用HPLC/MS/UV检测器创建一种新的分析方法，对50种结构不同的有机物在储存和生物筛选过程中的自校正绝对定量法的可行性应用进行评价。 论文的主要工作及其结果如下： 第一部分，为了研究Ox及其CQ对H460细胞的活性是否依赖于Cu2+，我们比较了三种不同的加药方式对H460细胞的生长抑制作用，测定三种不同加药条件下H460细胞中Cu2+的含量，运用紫外光谱滴定法测定Ox-Cu2+和CQ-Cu2+在体外细胞环境中的结合常数Kb1和Kb2。结果发现这两种有机配体本身具有抑制H460细胞生长的活性，且Ox的活性比CQ的活性强，内源铜的介入可以促进有机配体对H460细胞的生长抑制作用。通过测定细胞中Cu2+含量，发现有机配体CQ、Ox能促使细胞中Cu2+含量的升高，利用光谱分析测得Ox、CQ能有效的结合Cu2+，Ox-Cu2+的结合常数Kb1比CQ-Cu2+结合常数Kb2大。 第二部分，我们研究了70个Ox类似物对H460细胞的毒性，结果发现当Ox及其CQ的8位-OH被其它取代基取代后对H460细胞没有毒性，Ox类似物的抗肿瘤活性依赖于Cu2+，内源性Cu2+存在时17个Ox类似物表现出抗肿瘤活性。通过比较17个抗肿瘤活性依赖于铜的Ox类似物的IC50，发现类似物1＃、5＃、6＃和115＃对癌细胞生长的抑制作用较强，但是比Ox、CQ弱。利用紫外光谱分析这些化合物与Cu2+的结合作用，发现Ox类似物与Cu2+不结合。 第三部分，通过进一步研究Ox、CQ及其17个有活性的化合物对H460细胞的生长抑制作用，发现17个化合物在内源性铜的介入下对H460细胞的生长抑制作用增强。着重研究115＃、CQ、Ox对细胞中Cu2+含量的影响，发现Ox及其类似物能促使细胞内铜含量的升高，其中Ox把Cu2+带入细胞内的量比CQ带入的多；而类似物115＃带入Cu2+的量较少。另外我们测定了有无内源性铜的条件下，H460细胞中ROS的水平变化，发现加入Ox、CQ、及其有活性的17个化合物都能促使H460细胞中ROS含量的升高，但是通过比较发现ROS含量的升高不是化合物抑制H460细胞增殖的主要原因。 第四部分，运用HPLC/MS/UV检测器，对用于生物活性筛选的50个不同结构的化合物进行绝对定量，发现HPLC/MS/UV检测器绝对定量对用于生物活性筛选的药物具有一定的优势：在化合物的生物活性试验中，有利于高通量筛储存已久的化合物，测定其真实浓度，用于前期筛选和IC50的测定；有利于对因储存已久而被分解的药品进行重新收集和再分析。 结论： 1）Ox、CQ能有效的抑制H460细胞的增殖，在内源性铜的参与下Ox、CQ对H460细胞的生长抑制作用加强，其抑制作用可能与有机配体和铜的结合能力有关； 2）Ox类似物当8位羟基被取代后对H460细胞没有毒性，说明Ox及其CQ的8位羟基是羟基喹啉类化合物的抗癌活性位点。Ox类似物的抗肿瘤活性依赖于内源性铜，但是其机制与化合物和铜的结合机制无关。 3）Ox、CQ及其Ox类似物对H460细胞的生长抑制作用均依赖于铜，能促进细胞内铜升高。但是这种依赖机制不完全是由于结合作用产生的。 4）OX、CQ及其OX类似物可以促使H460细胞中ROS含量升高，但是ROS升高不是化合物抑制H460细胞生长的主要因素。 5）运用HPLC/MS/UV检测器对储存已久的药物进行绝对定量是可行的，但是具有一定的局限性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

第一章 前言

1.1细胞内的铜

1.1.1细胞内铜的形态

1.1.2铜的胞内运输

1.1.3细胞内含铜蛋白

1.1.4肿瘤组织中铜含量的测定

1.2铜与肿瘤发生的关系

1.3抗铜试剂

1.3.1上市的抗铜试剂

1.3.2 5-氯-7-碘-8-羟基喹啉

1.4有机铜配合物是一种的新型的蛋白酶体抑制剂

1.5其它含铜化合物的抗肿瘤活性

1.6组合化学

1.7本研究工作的意义与前景

本章参考文献

第二章 Ox和CQ对H460细胞生长抑制作用的初步研究

2.1引言

2.2实验材料与仪器

2.3实验方法

2.3.1 H460细胞的培养

2.3.2 H460细胞中Cu2+浓度的测定

2.3.3 CuCh对H460细胞毒性的测定

2.3.4 CQ与Ox在不同条件下对H460细胞抑制率的检测

2.3.5 光谱滴定法测定CQ-Cu2+和Ox-Cu2+在水中的结合常数Kb

2.3.6 不同加药条件下H460细胞中Cu2+含量的测定

2.4结果与讨论

2.4.1铜离子对H460细胞的影响

2.4.2 CQ、Ox在不同条件下对H460细胞的生长抑制作用

2.4.3 CQ—Cu2+和Ox-Cu2+结合常数对H460细胞生长抑制作用的影响

2.4.4 H460肺癌细胞中Cu2+含量的测定

2.5结论

本章参考文献

第三章 Ox类似物化合物库的活性筛选

3.1引言

3.2实验材料与仪器

3.3实验方法

3.3.1 6个8位-OH被小分子烷烃取代的Ox类似物

3.3.2 别外64个Ox化合物(N-取代-2-(喹啉-8-氧)乙酰胺化合物库)设计、合成与表征

3.3.3 H460细胞培养

3.3.4 Ox类似物的活性筛选

3.3.5 紫外光谱滴定法研究Ox、CQ及其类似物与Cu(Ⅱ)的结合作用

3.4结果与讨论

3.4.1 6个Ox类似物的活性比较

3.4.2 Ox类似物化合物库活性筛选

3.4.3 Ox类似物库与两种不同金属混合后对H460细胞的活性

3.4.4 结合作用与细胞增殖的关系

3.5结论

本章参考文献

第四章 Ox及其类似物体外抗癌机理的初步探讨

4.1引言

4.2实验材料与仪器

4.2.1实验材料

4.2.2主要实验仪器

4.3实验方法

4.3.1 H460细胞的培养

4.3.2 6个Ox类似物物在四种不同条件下对H460细胞活性检测

4.3.3 Ox类似物化合物库在四种不同条件下对H460细胞的活性检测

4.3.4 H460细胞中Cu2+浓度的测定

4.3.5 H460细胞活性氧的测定

4.4结果与讨论

4.4.1四种不同条件下6个Ox衍生物对H460细胞生长的抑制作用

4.4.2四种不同条件下Ox类似物对H460细胞生长的抑制作用

4.4.3 Ox类似物对H460细胞中Cu2+浓度的影响

4.4.4 H460细胞中ROS测定

4.5结论

本章参考文献

第五章 LC／MS／UV自校正法对有机物绝对定量的可行性分析

5.1引言

5.2实验材料与仪器

5.2.1实验材料

5.2.2实验仪器

5.3实验方法

5.3.1样品标准溶液的制备与绝对定量

5.3.2将有机物分解并进行绝对定量

5.3.3对培养基中的有机物进行绝对定量

5.4结果与讨论

5.4.1有机物绝对定量的方法评价

5.4.2 HPLC／MS／UV对有机物的绝对定量

5.4.3 HPLC／MS/UV对分解后的有机物的绝对定量

5.4.4 HPLC／MS／UV对生物活性筛选中的药物的绝对定量

5.5小结

本章参考文献

第六章 总结与展望

6.1总结

6.2展望

附 图

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致谢