PDGF-C及其变体在肾透明细胞癌中的表达与调节

摘要

目的：基于本课题组已经发现的一种血小板源性生长因子C（PDGF-C）的变体--血小板源性生长因子Cb（PDGF-Cb），探讨PDGF-C及其变体PDGF-Cb在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，RCC）与相应的正常肾组织中的表达调节及其意义，研究PDGF-C及其变体PDGF-Cb在肾肿瘤发生发展过程中可能的作用。 方法：用生物信息学方法进行搜索和比较鉴定出一种PDGF-C变体，用Western blotting检测蛋白质的表达，通过免疫荧光分析进行细胞内定位。采用RT-PCR方法检测30例原发性肾透明细胞癌及相对应的正常肾组织中的PDGF-C，并探讨PDGF-C和PDGF-Cb表达的关系。观察顺铂（cisplatin）对肾癌细胞株PDGF-C和PDGF-Cb mRNA表达的调节作用。采用SPSS11.5进行统计分析，在统计分析过程中，用配对t检验来评估RCC组织和配对的正常肾组织中PDGF-C和PDGF-Cb mRNA表达水平的差异。 结果： 1. 从人PDGF-C基因中鉴别出PDGF-Cb，它包括7个外显子，和原始的PDGF-C mRNA的区别仅在于多了一个外显子2a。PDGF-Cb编码一个较短的蛋白，由182个氨基酸组成，缺乏信号肽和CUB域，但是和PDGF-C的C端完全相同（包括全部的GFD）。预测PDGF-Cb的分子量为20.6kDa。 2. 在哺乳动物中PDGF-Cb是高度保守的，两种PDGF-C变体在所有检测的成人和胚胎组织中都是同时表达的，它们的相对表达量之间有所不同。和相应的正常肾组织相比，肾癌组织中PDGF-C mRNA表达上调，PDGF-C/-Cb的比率明显提高。 3. 重组PDGF-Cb在COS-7细胞中的表达结果显示两种PDGF-C变体都存在于内质网（endoplasmic reticulum，ER），在转染的COS-7细胞中PDGF-C和PDGF-Cb可形成异源二聚体。 4. 在mRNA水平，顺铂对PDGF-C及PDGF-Cb呈下调作用，对PDGF-Cb的下调作用呈剂量依赖性。 结论： 1. PDGF-C存在变体PDGF-Cb，是由于在PDGF-C的内含子1中插入一个新的61个核苷酸长的外显子（命名为外显子2a）而产生的。 2. 在哺乳动物中PDGF-Cb是高度保守的，在不同物种中，外显子2a有93-98％的一致性。这增强了本研究的意义，也进一步提示这种新的变体可能是阐明PDGF-C生理学作用的一个有用的工具。 3. PDGF-Cb定位于细胞内，不能分泌到细胞外基质中，但可在细胞内与PDGF-C形成异源二聚体，从而影响其分泌。PDGF-Cb反向调节PDGF-C的分泌，且其对PDGF-C表达的调节作用可能与肾细胞癌的致癌性相关。 4. 顺铂对肾癌细胞株PDGF-C和PDGF-Cb mRNA表达的调节作用为肾癌的致癌机理研究提供了可能的途径。

目录

文摘

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第一章 前言

第二章 PDGF及肾癌的分子治疗研究进展

2.1 PDGF基本结构和作用方式

2.2 PDGF的变体及生物学特性

2.3肾癌的分子治疗

2.4小结

第三章 资料与方法

3.1生物信息学方法

3.2细胞培养和试剂

3.3 PDGF—C变体的鉴定

3.4对人正常组织中PDGF—C的两种变体进行RT—PCR分析

3.5肾癌细胞株培养

3.6肾细胞癌样本的获取，RNA抽提，cDNA合成以及RT—PCR

3.7 PDGF—C mRNA的实时定量PCR

3.8两种人PDGF—C变体的分离和序列分析

3.9构建PDGF-C和PDGF—Cb的表达载体

3.10转染后PDGF—C变体的表达和Western blotting蛋白检测

3.11原位定向突变

3.12细胞内定位的免疫荧光分析

3.13统计学分析

第四章 结果

4.1从人PDGF—C基因中鉴别出变体PDGF—Cb

4.2 PDGF—C和PDGF—Cb在正常组织中的表达

4.3肾细胞癌组织和正常肾组织中PDGF—C和PDGF—Cb表达的差异

4.4顺铂对肾癌细胞株PDGF—C及PDGF—Cb的调节作用

4.5重组PDGF—Cb在COS-7细胞中的表达特征

4.6 PDGF—C和PDGF—Cb可形成异源二聚体

4.7 PDGF—Cb可能通过形成异源二聚体调节全长PDGF—C的分泌

第五章 讨论

第六章 结论

6.1 PDGF—C存在一种变体PDGF—Cb

6.2 PDGF—Cb在肾细胞癌中具有独特的分泌特征

6.3 PDGF—C及PDGF—Cb对肾透明细胞癌发生发展可能的调节作用

附表

附图

参考文献

致谢

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