酵母异源表达瑞氏木霉纤维素酶特性研究

摘要

乙醇最有发展前景的可再生液体燃料。面对世界人口的急剧膨胀和粮食短缺，用粮食生产酒精的发展将受到限制。近年来，利用重组酵母直接生物转化纤维素生成酒精，由于其工艺设备简单、成本低而被认为具有良好的发展前景，并成为世界各国近年来重点研究的方向。
　　 酵母由于其转化和表达的高效性是一种良好的异源表达宿主，许多来源于真菌的纤维素酶已经被表达于酿酒酵母中，并获得了具有活性的重组酶蛋白。然而酵母表达外源纤维素酶基因的水平非常有限，酶活也存在较大幅度的下降。其中，纤维素酶系的主要组分之一Ce17A(占瑞氏木霉分泌纤维素酶60％的质量分数，为作用于纤维素结晶区的关键酶)，在酿酒酵母和毕赤氏酵母中的表达被发现是高度糖基化的，有的没有活性(Hong J et al.2003)，有的较野生型酶的酶活有较大程度的下降(Lynd LR et al.2002；Godbole S et al.1999；Boer H et al.2000)。而纤维素酶酶系中重要的内切酶Ce15A，在酵母中异源表达，表达量较其来源的瑞氏木霉，存在着大幅度的下降(肖志状等2001)。
　　 本文通过瑞氏木霉纤维素外切酶Ce17A的四个N-糖基化位点突变子分别在毕赤氏酵母的表达，比较研究了Ce17A高糖基化对酶在酵母中表达酶活力的影响，并得到Ce17A异源表达酶活提高的突变体酶；构建了酿酒酵母致突变菌，并将表达有瑞氏木霉纤维素内切酶Ce15A的酿酒酵母致突变菌进行定向筛选，得到了纤维素酶内切酶Ce15A异源酶表达量提高的突变菌株。这不仅提高了纤维素酶在酵母宿主中的异源表达的酶活和酶表达量，也为蛋白质在酵母中的蛋白工程改造提供了有用的信息与平台。
　　 本论文的主要研究成果如下：
　　 1. Ce17A在毕赤氏酵母中异源表达N-糖基化的研究。
　　 通过点突变对Ce17A的N-糖基化位点进行改造，将45、64、270和384位四个N—糖基化位点的天冬酰胺突变为丝氨酸，构建重组质粒并将其在p.pastoris中进行表达，获得单独表达外切纤维素酶的酵母菌株，以此来研究高糖基化对Ce17A在酵母表达中的影响。研究证明，Asn64位的糖基化对毕赤酵母中表达的Cel7A酶活力影响较大，此位点的突变使rCe17A的酶活提高了7倍。对Ce17A及其四个N一糖基化位点的三级结构进行分析，结果表明Asn64基本上处于蛋白内部，残基周围可容纳糖基化的空间很小。Asn64残基若要被糖基化，至少会显著改变局部结构，甚至可能影响整体结构和酶活。另外，rCe17A N64S突变体的酶活仍然远低于野生型，这说明Asn64位的糖基化可能只是影响Ce17A在毕赤酵母中表达后活性的一个方面。蛋白质折叠机制的差异和共翻译糖基化对Ce17A二硫键和tunnel结构的形成具有重要影响。
　　 2.致突变菌的构建和Ce1SA高表达突变子的获得。
　　 成功通过ctt1，sod1,Srx1三个氧化损伤清除基因的敲除，构建了三株致突变菌株，RDKY3615(△CTT)、RDKY3615(△SOD)和RDKY3615(△SRX)，测定了致突变菌的生长情况和对H2O2的敏感性，并通过报告质粒中kanamycin抗性基因的回复突变，确定了H2O2浓度和处理时间对突变率的影响。将Ce15A在致突变菌RDKY3615(△CTT)和RDKY3615(△SOD)中表达，经双氧水处理和大量的CMC双层平板筛选，获得了一系列大水解圈突变株。经过液体发酵和上清液总酶活的测定，筛选出15株酶活较野生型明显提高的菌株，其中RDKY3615(△CTT)-Ce15A突变株11株，RDKY3615(△SOD)-Ce15A突变株4株，最高相对酶活较野生型提高了10.1倍。经过蛋白质的定量和比酶活的计算，发现所得高酶活突变株，其总酶活的提高是由于Cel5A表达量的提高。测序结果表明，Ce15A基因本身并没有发生突变，突变菌株酶活的提高是由于酿酒酵母基因组发生了可遗传的突变。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

1.1纤维素酶

1.1.1纤维素酶的命名

1.1.2纤维素酶的性质，与瑞氏木霉的纤维素酶

1.2纤维素酶在酵母中的异源表达

1.2.1纤维素酶在酿酒酵母中表达

1.2.2纤维素酶在毕赤氏酵母中表达

1.3.纤维素外切酶Cel7A在酵母中异源表达的N-糖基化情况

1.3.1瑞氏木霉中Cel7A的糖基化

1.3.2 Cel7A在酵母中的糖基化

1.4致突变菌

1.5本研究的目的与主要工作内容

第二章外切纤维素酶Cel7A的糖基化位点改造

2.1.材料与方法

2.1.1菌株和质粒

2.1.2酶和试剂

2.1.3培养基和溶液

2.1.4菌种活化，提取质粒

2.1.5点突变引物的设计

2.1.6点突变方法

2.1.7 Cel7A基因及其突变体N45S/N64S/N270S/N384S的PCR扩增条件

2.2结果与讨论

结论

第三章Cel7A及其突变体在毕赤酵母中的表达与研究

3.1材料与方法

3.1.1菌株和质粒

3.1.2工具酶、试剂和仪器

3.1.3培养基和溶液

3.1.4载体质粒pPIC9K的提取，目的基因与载体的限制性内切酶消化反应

3.1.5线状载体质粒pPIC9K的去磷酸化处理，目的基因与载体的连接反应

3.1.6连接液的乙醇沉淀

3.1.7大肠杆菌感受态细胞的制备，电击转化

3.1.8大肠杆菌转化子的验证

3.1.9重组质粒的线性化

3.1.10毕赤酵母电转化

3.1.11外源蛋白的诱导表达

3.1.12胞外蛋白表达情况的SDS-PAGE检测

3.1.13酶活性测定

3.1.14粗酶液的制备

3.1.15超滤浓缩

3.1.16离子交换层析

3.1.17 Cel7A的三级结构模拟，残基暴露表面积和相邻残基数目的计算

3.2结果与讨论

3.2.1 Cel7A及其突变体在酵母中异源表达的重组质粒的构建

3.2.2 Cel7A及其突变子在毕赤氏酵母中表达与酶活的比较研究

3.2.3 Cel7A及其四个糖基化位点的三级结构分析

结论

第四章酿酒酵母致突变菌株的构建及性质研究

4.1材料与方法

4.1.1菌株和质粒

4.1.2工具酶和试剂

4.1.3培养基和溶液

4.1.4敲除片段获得和纯化

4.1.5敲除片断电转化酿酒酵母

4.1.6转化子验证

4.1.7致突变菌株生长情况的测定

4.1.8不同H2O2浓度诱导条件下致突变菌株存活率的测定

4.1.9构建kanamycin抗性报告质粒

4.1.10致突变菌株kanamycin抗性回复突变率的测定

4.2结果与分析

4.2.1致突变菌株构建

4.2.2致突变菌的生长情况研究

4.2.3不同浓度双氧水处理下的RDKY3615(△CTT)和RDKY3615(△SOD)的存活率

4.2.4回复突变率测定的kanamycin抗性报告质粒的构建

4.2.5 kanamycin抗性基因回复突变率的测定

结论

第五章Cel5A在致突变菌株中的突变与高酶活突变株的筛选

5.1材料与方法

5.1.1菌株和质粒

5.1.2工具酶、试剂和仪器

5.1.3培养基和溶液

5.1.4表达质粒pGADT7—Cel5A的构建，酶切验证

5.1.5 pGADT7—Cel5A转化酿酒酵母致突变菌株

5.1.6 SDS电泳检测发酵液中内切酶

5.1.7活性染色

5.1.8双氧水处理突变

5.1.9刚果红染色平板筛选高酶活突变株

5.1.10内切酶酶活性测定

5.2结果与分析

5.2.1瑞氏木霉内切纤维素酶Cel5A在致突变菌中的表达

5.2.2表达有Cel5A的大水解圈致突变菌突变子的筛选

5.2.3表达有Cel5A的大水解圈致突变菌突变子的酶活性测定

5.2.4致突变菌发酵液的SDS电泳与活性染色

5.2.5高酶活性突变子的比酶活比较及基因测序

结论

全文总结与展望

1本论文取得的创新性结果

2本论文存在的问题及深入方向

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢