腺病毒介导的NEP基因对Aβ诱导的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种多发于老年人的中枢神经系统退行性疾病，至今其发病机制尚未阐明并缺乏有效的治疗方法。但绝大多数研究者认同阿尔茨海默症是一种由于基因缺陷直接或间接改变淀粉样蛋白前体表达或蛋白酶解过程从而影响β-淀粉样肽聚集稳定性的病理综合症，细胞外β-淀粉样肽（P-amyloid peptide,AP）沉积是AD主要病理学特征之一，并可能是启动AD发病的关键因素。β-淀粉样肽，为39～43个氨基酸组成的一组多肽，是老年斑的主要成分，也是阿尔茨海默症的主要致病物质，由淀粉样蛋白前体经β-、Υ-分泌酶次序降解产生，可被某些肽酶降解清除。目前已发现数种有降解Aβ-活性的内肽酶，主要有Ncprilysin(NEP)、内皮素转换酶和胰岛素降解酶3种，其中NEP是调节脑内Aβ分解代谢的最重要的酶。近年来发现，Nepdlysin(NEP)，也称中性内肽酶，其数量改变或活性变化在Aβ沉积中扮演重要角色，是脑内催化Aβ降解的关键酶，是调节大脑Aβ水平的重要因素。AD患者脑中表现的NEP表达降低可能是导致.Aβ沉积的关键因素。因此，上调NEP在AD病的治疗中是非常有前景的。本实验将携带NEP基因的腺病毒载体转入SK-N-SH细胞，观察其对Aβ所致的神经细胞凋亡的抑制作用。
　　 【研究目的】
　　 研究脑中性内肽酶(NEP)外源表达对神经毒性物质β-淀粉样肽（Aβ25-36）诱导损伤的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用。
　　 【研究方法】
　　 (1)用脂质体将含中性内肽酶(NEP)的腺病毒骨架质粒转染293细胞，制备高滴度病毒颗粒，经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒Ad-nep进行鉴定
　　 (2)感染入神经母细胞瘤SK-N-SH细胞；采用RT-PCR和Western blot法分析检测NEP的表达水平：感染内源性损伤的SK-N-SH细胞(sweAPP-SK)，采用Elisa法初步检测NEP对AP的降解程度。
　　 (3)感染Aβ26-35处理的外源损伤的入神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞)，采用MTT法检测细胞存活率、流式细胞术分析细胞凋亡状态和细胞内活性氧水平、RT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因bcl-2及bax的表达情况。
　　 【结果】
　　 (1)成功包装重组腺病毒Ad--NEP和对照病毒Ad--GFP：重组腺病毒能感染入神经母细胞瘤SK-N-SH细胞并检测到目的基因的高表达，Elisa结果显示，NEP高表达有明显减轻β一淀粉样肽(Aβ)在细胞外累积的作用。
　　 (2)细胞存活率及流式细胞术检测结果显示，NEP高表达可明显减轻Aβ25-35诱导的细胞凋亡及减低细胞内活性氧水平，RT-PCR和Western blot结果显示，NEP对Aβ26-35诱导的细胞凋亡的抑制作用可能是通过减少促凋亡基因bax的表达以及降低细胞内活性氧水平来实现的。
　　 【结论】
　　 一定剂量的Aβ25-35能造成适当的AD病理性细胞损伤模型，通过重组腺病毒Ad-nep的感染使nep基因高表达能对抗Aβ神经毒性：感染AD-NEP的神经细胞通过NEP高表达可以明显减轻Aβ累积，抑制神经细胞凋亡，提高细胞的存活率，NEP对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有一定的保护作用，此过程的分子机制可能与降低细胞外Aβ的沉积、细胞内活性氧水平以及促凋亡因子bax的表达有关，本研究为探索以中性内肽酶为靶蛋白的AD基因治疗策略提供有价值的实验证据。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

前言

方法

重组腺病毒Ad-ncp的包装、扩增和表达鉴定

重组腺病毒的神经保护作用

统计学处理

结果

重组腺病毒骨架质粒pAd-nep的初步鉴定

重组腺病毒的包装

重组腺病毒滴度测定及目的基因nep的鉴定

重组腺病毒感染入神经母细胞瘤细胞SK-N-SH

RT-PCR法检测重组腺病毒感染SK-N-SH后ncp基因表达

Western blot检测Ad-ncp重组腺病毒感染SK-N-SH后NEP蛋白表达

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Ad-nep降Aβ作用的

MTT法检测细胞存活率

流式细胞术检测细胞凋亡

RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-2、bax的表达

Western blotting检测bd-2、bax的蛋白表达

流式细胞术检测细胞内活性氧

讨论

小结

参考文献

致谢

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