血管外膜激活促进移植性血管病新内膜形成及发展的实验研究

摘要

目的:
　　 本实验利用袖套管技术将大鼠胸主动脉移植到腹主动脉建立移植性血管病模型,通过在体动物实验以及体外培养移植血管外膜成纤维细胞,观察血管外膜细胞表型转化、增殖、迁移以及多种细胞因子在mRNA和蛋白水平表达的动态变化,进一步探讨血管外膜以及外膜成纤维细胞激活在移植性血管病新内膜形成及发展中的作用机制。在以上实验基础上,本研究进一步探讨应用RNA干扰技术特异性地抑制NADPH氧化酶亚基p47phox的表达,从而下调NADPH氧化酶的活性,观察其对移植血管外膜成纤维细胞增殖和迁移的抑制作用,为移植性血管病以血管外膜成纤维细胞为作用靶点进行基因治疗提供实验依据。
　　 本课题分以下三个部分进行研究:
　　 第一部分:移植性血管病大鼠模型的建立
　　 方法:
　　 以Sprague-Dawley大鼠的胸主动脉为供体血管,利用袖套管技术移植到Wistar大鼠腹主动脉作为异系移植实验组,以SD大鼠对SD大鼠同系移植作为对照组。在血管移植后3,7,14天,取出移植的胸主动脉,进行苏木素-伊红染色及Weigert弹力纤维染色,应用Image-Pro Plus5.0计算机图像分析系统检测移植血管的内膜和中膜增生情况及内膜/中膜厚度比值。
　　 结果:
　　 手术成功率为90％,移植血管的通畅率达100％。同系移植对照组在各个时间点未出现内膜的明显增生,而异系移植实验组在移植后7天出现内膜增生,术后14天内膜厚度显著增加。对照组和实验组移植血管中膜均未见明显增厚。异系移植实验组内膜/中膜厚度比值在移植后7天开始增高,14天时达到顶峰。
　　 结论:
　　 利用袖套管技术进行SD和Wistar大鼠间的血管移植符合移植性血管病的病理形态改变,并且操作简单,费用小,重复性好,可以用于研究移植性血管病的病理机制及干预治疗。
　　 第二部分:在体动物实验研究血管外膜激活在移植性血管病新内膜形成及发展中的作用
　　 方法:
　　 在血管移植后3,7,14天,取出移植的胸主动脉。用免疫组织化学方法观察不同时间点血管外膜和内膜波形蛋白,α平滑肌肌动蛋白,T细胞抗原受体CD3,细胞核增殖抗原Ki-67,核因子-κB,MCP-1,细胞间粘附分子-1,血管细胞粘附分子-1,基质金属蛋白酶-7,TGF-β1,硝基酪氨酸及p47phox等细胞因子蛋白水平表达的动态变化；用荧光原位杂交技术检测gp91phox mRNA的表达水平；用荧光实时定量聚合酶链反应检测移植血管外膜MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox等细胞因子mRNA的表达水平。
　　 结果:
　　 1.免疫组织化学检测显示异系移植实验组和同系移植对照组在血管移植后不同时间点,移植血管外膜及内膜或新内膜的大部分细胞呈现vimentin阳性,中膜几乎无阳性细胞。异系移植实验组在术后3天移植血管外膜部分细胞即呈现α-SMA阳性,随着时间延长α-SMA阳性细胞数量逐渐增加,术后7天和14天新内膜细胞也开始表达α-SMA,而同系移植对照组血管外膜及内膜细胞几乎无α-SMA阳性表达:两组移植血管中膜α-SMA始终呈强阳性表达。
　　 2.异系移植实验组和同系移植对照组在血管移植后不同时间点移植血管外膜及内膜或新内膜T细胞抗原受体CD3阳性细胞不超过4％,说明增生的细胞主要是外膜成纤维细胞,新内膜形成可能主要与外膜成纤维细胞有关。
　　 3.Ki-67免疫组织化学结果显示在术后3天异系移植实验组外膜成纤维细胞开始出现增殖,内膜细胞仅有少量细胞增殖,在术后7天和14天外膜成纤维细胞及内膜细胞均显著增生；同系移植对照组术后外膜仅出现少量细胞增生。两组移植血管中膜平滑肌细胞未见增生细胞,中膜厚度也未见明显改变。
　　 4.免疫组织化学结果显示在术后3天异系移植实验组外膜成纤维细胞开始出现NF-κB,MCP-1,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,硝基酪氨酸,p47phox的表达,内膜有少量阳性细胞,在术后7天和14天外膜成纤维细胞及内膜细胞细胞因子表达均显著增加；同系移植对照组仅NF-κB,MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、硝基酪氨酸在术后外膜出现少量阳性表达细胞,内膜未检测到阳性细胞。
　　 5.荧光原位杂交技术显示在术后3天异系移植实验组外膜成纤维细胞检测到gp91phox mRNA表达,在术后7天和14天外膜成纤维细胞gp91phox mRNA表达显著增加,内膜仅有少量gp91phox mRNA表达；同系移植对照组未检测到gp91phoxmRNA表达。
　　 6.QRT-PCR结果显示与同系移植对照组相比,异系移植实验组外膜成纤维细胞MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phoxmRNA均在术后3天开始表达,术后14天达到顶峰。
　　 结论:
　　 1.在移植性血管病早期新内膜形成前,动脉外膜首先被激活,主要表现为外膜成纤维细胞被激活,开始表达α-SMA,表型转化为肌成纤维细胞,增殖活性增强,合成释放多种活性细胞因子,促进移植性血管病新内膜形成及发展。
　　 2.动脉外膜炎症是移植性血管病新内膜形成及发展过程中的早期事件之一,有可能促进血管新内膜的形成。
　　 3.氧化应激贯穿于移植性血管病新内膜形成及发展整个过程中,可能是血管外膜成纤维细胞被激活的因为之一,并进而促进移植性血管病新内膜形成及发展。
　　 第三部分:体外培养大鼠血管外膜成纤维细胞研究其在移植性血管病新内膜形成及发展中的作用
　　 方法:
　　 异系移植实验组和同系移植对照组在血管移植后14天分别取出移植胸主动脉,将血管外膜剥离,用组织块培养法体外培养血管外膜成纤维细胞,取3～6代细胞用于实验。用免疫细胞荧光染色检测vimentin,α-SMA及结蛋白desmin的表达；用细胞计数试剂盒及5-溴-2-脱氧尿嘧啶掺入法检测细胞增殖活性的变化；用流式细胞仪PI染色法检测细胞周期；用插入式24孔Transwell小室及划痕实验检测细胞的迁移能力；用逆转录聚合酶链反应检澳 MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox等细胞因子mRNA的表达水平；用Western blot方法检测MCP-1,ICAM-1,TGF-β1,和p47phox等细胞因子蛋白的表达水平:设计合成靶向NADPH氧化酶亚基p47phox基因的小分子干扰RNA,并进行筛选得到具有高效干扰效率的siRNA,转染异系移植实验组体外培养血管外膜成纤维细胞,观察其对血管外膜成纤维细胞NADPH氧化酶的抑制作用及其对外膜成纤维细胞增殖和迁移活性的抑制作用。
　　 结果:
　　 1.用组织块培养法培养的异系移植实验组和同系移植对照组血管外膜细胞,4～7天后可见细胞从组织块边缘游出,贴壁生长,10～14天后达到90％细胞融合。异系移植实验组血管外膜细胞呈现vimentin(+)、desmin(-)、约90％的细胞呈现α-SMA(+)；同系移植对照组血管外膜细胞呈现vimentin(+)、desmin(-)、90％以上的细胞呈现α-SMA(-)。
　　 2.血清浓度为1％时,异系移植实验组和同系移植对照组培养血管外膜成纤维细胞细胞增殖活性无显著性差异,血清浓度为5％和10％时,异系移植实验组血管外膜成纤维细胞增殖活性显著高于同系移植对照组；血清浓度为10％时,BrdU掺入法也得到相同结果。流式细胞仪PI染色法显示异系移植实验组血管外膜成纤维细胞S期及G2/M期所占百分比显著高于同系移植对照组。
　　 3.插入式24孔Transwell小室实验显示异系移植实验组迁移到Transwell小室PET膜下表面的成纤维细胞数明显高于同系移植对照组；划痕实验也显示异系移植实验组血管外膜成纤维细胞的愈合速率要明显高于同系移植对照组。
　　 4.RT-PCR检测显示异系移植实验组血管外膜成纤维细胞MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox等细胞因子mRNA的表达水平均明显高于同系移植对照组。
　　 5.Western blot方法检测显示异系移植实验组血管外膜成纤维细胞MCP-1,ICAM-1,TGF-β1和p47phox等细胞因子蛋白的表达水平也明显高于同系移植对照组。
　　 6.p47phox-siRNA-2＃转染异系移植实验组体外培养血管外膜成纤维细胞48小时后可有效抑制p47phox基因在mRNA水平的表达,从而抑制NADPH氧化酶,并可以显著降低成纤维细胞的增殖和迁移活性。
　　 结论:
　　 1.约90％的异系移植实验组血管外膜细胞转化为肌成纤维细胞,而同系移植对照组90％以上的细胞为成纤维细胞。
　　 2.异系移植实验组血管外膜成纤维细胞的增殖及迁移能力明显高于同系移植对照组。
　　 3.异系移植实验组血管外膜成纤维细胞合成和释放多种活性细胞因子的能力明显高于同系移植对照组。
　　 4.氧化应激参与血管外膜成纤维细胞的激活,激活的成纤维细胞又可以生成更多的超氧阴离子,形成正反馈效应。
　　 5.NADPH氧化酶亚基p47phox基因siRNA可显著抑制成纤维细胞的增殖和迁移活性,从而可作为移植性血管病抑制新内膜形成的基因治疗新靶点。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

CONTENTS

符号说明

论文Ⅰ移植性血管病大鼠模型的构建

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

论文Ⅱ在体动物实验研究血管外膜激活在移植性血管病新内膜形成及发展中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

论文Ⅲ体外培养大鼠血管外膜成纤维细胞研究其在移植性血管病新内膜形成及发展中的作用

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

附表

参考文献

创新点及局限性

致谢

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