脂联素对ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块和硝基化应激的作用及其机制

摘要

新近的研究表明脂肪组织是高度活跃的内分泌器官,脂联素(adiponectin,APN)是脂肪细胞分泌的“脂肪因子”。目前发现,脂联素是体内最重要的保护性脂肪因子,与糖尿病、代谢综合征以及动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展存在重要的关系。脂联素能够减少脂质斑块的面积,改善内皮细胞功能,抑制平滑肌细胞的增殖与迁移,减少基质降解稳定斑块,通过这些途径发挥抗动脉粥样硬化的作用。因此,深入研究脂联素对动脉粥样硬化的作用及其机制,为防治动脉粥样硬化具有重要的理论和临床意义。
　　 已知氧化应激是AS发生的重要机制之一,氧化应激产物活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)可以与炎症状态下产生的大量一氧化氮(NO)结合生成过氧化亚硝基阴离子(ONOO-),启动硝基化应激,损害蛋白质的功能和酶的活性,造成细胞凋亡。大量研究已经表明,脂蛋白过氧化和内皮细胞受损是AS的始动环节,而硝基化应激产生的ONOO-正是脂蛋白过氧化和内皮细胞受损的主要物质之一。
　　 目前国际国内对脂联素作用的研究主要集中在脂肪组织分泌脂联素经内分泌途径改善血管内皮细胞的功能,而在血管外膜周围分布有一定量的脂肪组织,能够分泌脂联素,这些脂联素能否通过血管外膜直接作用于邻近血管内斑块尚不完全明了。我们的前期研究表明,血管外膜成纤维细胞上存在脂联素受体,且动脉粥样硬化病变血管内膜或外膜转染脂联素后斑块面积缩小,同时血清脂联素浓度升高。因此,本研究通过ApoE-/-小鼠颈动脉外膜局部转染脂联素进一步观察其对AS斑块的作用及对斑块内硝基化应激的影响,探讨脂联素抑制斑块的作用机制。
　　 目的：
　　 1.观察脂联素对ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块的作用；
　　 2.探讨脂联素对斑块内硝基化应激的作用及其可能机制；
　　 3.观察脂联素对斑块局部血流剪切力的影响,探讨其抑制斑块的其他可能机制。
　　 研究方法
　　 1.模型的建立:8周龄ApoE-/-小鼠(n=50),高胆固醇饲料喂养3周后进行右侧颈总动脉套管手术。术后5周随机分为三组,假手术对照组(n=15):血管外膜滴加生理盐水；空载体对照组(n=15):外膜腺病毒空载体孵育；脂联素组(n=20):血管外膜脂联素腺病毒载体孵育。2周后过量麻醉抽血,离心分离血清备用,处死动物,取右侧颈总动脉做组织学检测,多聚甲醛灌注留取组织做病理学检查。
　　 2.小鼠体表超声检测:于实验开始时、8周末、10周末进行体表超声检查,测量最大斑块厚度、最大斑块面积、血流峰值速度(Vp)、收缩期内径(Ds)、剪切力(SS)。
　　 3.病毒转染效率检测:转染5天后,通过荧光显微镜观察颈动脉切片GFP表达。
　　 4.免疫印迹(Westernblot)技术:检测斑块局部脂联素蛋白质表达情况。
　　 5.病理学检测:颈动脉斑块组织学切片分别行HE、油红O、Masson染色、免疫组织化学染色,观察斑块大小及形态、斑块内脂质、平滑肌细胞、胶原纤维、巨噬细胞变化。
　　 6.酶联免疫吸附法(ELISA):检测斑块局部硝基酪氨酸(nitrotyrosine)水平。
　　 7.化学显色法:检测斑块局部一氧化氮水平。
　　 8.荧光染色法:检测斑块局部超氧阴离子(O-2)水平。
　　 9.统计学分析:所有数据均采用(x)±s表示,采用SPSS16.0分析软件,计量资料采用t检验及方差分析,三组以上均数有显著性差异时,采用两两比较q检验,以P<0.05为有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.动物的基本特征:空载体对照组和脂联素组各有1只小鼠于转染病毒后死亡,其余动物全部完成实验。小鼠体重8周末与实验开始时相比明显增加(P<0.01),10周末各组间及与8周末相比体重无明显变化(P>0.05)。
　　 2.病毒转染效率检测:空载体对照组与脂联素组GFP在颈动脉斑块部位均明显表达绿色荧光,在心肌、肝、肾组织中几乎无表达。
　　 3.免疫印迹(Westernblot)检测:与假手术对照组和空载体对照组相比,脂联素组斑块局部脂联素表达明显升高(P<0.01)。
　　 4.小鼠体表超声检测:与假手术对照组和空载体对照组相比,脂联素组最大斑块厚度、最大斑块面积均显著减小(P<0.01)。
　　 与基础状态相比,8周末小鼠Vp、SS明显减小(P<0.01),Ds也减小,但未达到统计学意义(P>0.05)；与8周末相比,10周末各组小鼠Vp、Ds、SS均无明显变化；10周末与假手术对照组和空载体对照组相比,脂联素组Vp、SS亦无显著性差异(P>0.05),Ds脂联素组比假手术对照组增大(P<0.05),比空载体对照组明显增大(P<0.01)。
　　 5.病理学检测:与假手术对照组和空载体对照组相比,脂联素组HE染色显示斑块明显减小,油红O染色显示着色浅脂质含量少,Masson染色脂联素组斑块内平滑肌细胞增多而胶原纤维减少,巨噬细胞免疫组化染色显示斑块内巨噬细胞也明显减少。
　　 6.酶联免疫吸附法(ELISA):与假手术对照组和空载体对照组相比,脂联素组斑块内硝基酪氨酸含量均减少(P<0.05)。
　　 7.化学显色法:与假手术对照组和空载体对照组相比,脂联素组斑块内NO含量均明显减少(P<0.01)。
　　 8.荧光染色法:与假手术对照组和空载体对照组相比,脂联素组斑块内红色荧光明显减弱,O-2水平降低。
　　 结论：
　　 1.通过小鼠体表超声检测和病理学染色均证实脂联素能够减小斑块面积,且斑块内脂质、巨噬细胞均减少,说明脂联素可通过血管外膜局部干预发挥抗动脉粥样硬化斑块的作用。
　　 2.血管外膜转染脂联素后,斑块内硝基酪氨酸、一氧化氮、超氧阴离子水平均降低,说明脂联素可以抑制斑块内硝基化应激而消退斑块,这一作用可能是通过抑制氧化应激和炎症性一氧化氮生成而引起的。
　　 3.小鼠体表超声检查证明血管外膜转染脂联素对局部血管内斑块处血流速度和剪切力无明显影响,说明脂联素不通过影响剪切力发挥抗动脉粥样硬化的作用。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附表

附图

参考文献

致谢

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