环境化学物质VCD致卵巢早衰动物模型的构建

摘要

研究背景：
　　 卵巢早衰病因和机理比较复杂,尚没有合理有效的治疗方法。卵巢早衰可严重影响患者的生活质量,而且直接促进某些严重疾病的发生,如卵巢早衰导致年轻妇女不育、提前闭经等一系列内分泌变化,增加心血管疾病的发生率,导致骨质疏松。因此,进一步探讨卵巢早衰(POF)的病因学及寻求有效的治疗方法是解决这个疾病的关键。鉴于POF人体研究的可行性低,建立与人类相似的生殖内分泌和组织学变化的POF模型对于POF发病机制的研究和进一步治疗具有重要价值。
　　 女性生来具有有限的原始卵泡池,生后不可再生。绝大多数原始卵泡将走向闭锁,只有不到1％的卵泡发育成熟并排卵。因此,暴露于原始卵泡毒性的化学物质中的女性生育能力就会受到损害,也可能使女性提早绝经。有研究发现环境物质能破坏卵泡中的卵母细胞进而影响卵巢功能[1,2,3],由于人们接触到越来越多的环境化学物质制品,职业暴露可能增加不孕及卵巢早衰的危险。因此环境物质对卵巢毒性的影响越来越受到关注。
　　 VCD(4-vinylcyclohexene diepoxide)是VCH(4-vinylcyclohexene)的主要代谢产物之一,VCH产生于生产橡胶轮胎、阻燃剂、杀虫剂、可塑剂及抗氧化剂等的过程中,研究发现VCH和VCD能选择性破坏雌鼠和短尾猴卵巢内的原始卵泡和初级卵泡,最终引起雌鼠卵巢早衰[4,5],而VCD是VCH卵巢毒性的主要活性形式[6]。因此本研究选择VCD构建POF动物模型,通过观察阴道涂片及不同时间段卵巢组织学变化等判断造模效果,旨在观察卵巢逐步衰竭的过程及探讨该动物模型的成功率,和是否是能模拟生理性的卵巢早衰,为卵巢早衰的病因和治疗提供研究方法和实验依据。
　　 研究目的
　　 1.建立环境化学物质VCD致卵巢早衰小鼠模型。
　　 2.观察VCD作用下小鼠卵巢功能变化的相关指标。
　　 3.观察VCD用药后卵巢功能逐步衰竭的过程。
　　 4.提高人们对环境因素的关注。
　　 研究内容和方法
　　 1.研究对象:雌性昆明小鼠60只,28天龄,体重90±10 g,购自山东大学动物实验中心,温度控制在22±2℃,相对湿度为50％-6096,自由饮食,每天光照时间为12h。
　　 2.研究方法:
　　 2.1实验方案
　　 将60只小鼠随机分为VCD组、佐剂对照组、正常对照组和去势组四组,VCD组和芝麻油组分别每天腹腔注射同等量的VCD和芝麻油5ml/kg,注药2周后每天观察小鼠阴道涂片,观察小鼠动情周期变化。分别于注药后不同时间取卵巢和子宫组织做组织学检查,同时计数各级卵泡数目,观察小鼠子宫和卵巢的形态及组织学变化。
　　 2.2分组与用药
　　 将实验动物随机分为4组:A组:即VCD用药组20只,每天腹腔注射VCD160mg/kg,即5ml/kgVCD溶液(VCD溶于芝麻油中),连续注射15天;
　　 B组:佐剂对照组即芝麻油组16只,每天注射同等剂量芝麻油5ml/kg,连续注射15天;
　　 C组:即正常对照组20只,不做任何处理;
　　 D组:即去势组4只,于注药第1天行双侧卵巢切除术。
　　 2.3实验观察指标
　　 ①小鼠一般状态观察:观察处理后各组小鼠的活动、饮食及体重变化等情况。
　　 ②小鼠动情周期的观察:每天取小鼠阴道分泌物涂片并HE染色,观察小鼠动情周期变化情况。
　　 ③小鼠卵巢和子宫组织学变化:分别取不同时间段(d18,d37,d80和d120天)小鼠卵巢和子宫组织做病理切片并HE染色,切片厚度为5μm,每隔20μm取一张切片,光镜下观察小鼠卵巢和子宫的组织学改变。
　　 ④不同时间段卵泡计数:于注药后d18,d37,d80和d120天分别卵泡计数,为避免重复计数卵泡,原始卵泡和初级卵泡以卵母细胞核作为标记物计数,次级卵泡和窦卵泡以卵母细胞核仁为标记物计数。每只取20张切片分别计数各级卵泡数目。
　　 结果
　　 1.动情周期变化:注药d60天VCD组动情周期不规则数占80％,d80天全部紊乱。芝麻油组和正常对照组动情周期变化较稳定,去势组小鼠均处于动情间期,无动情周期变化
　　 2.卵泡计数和卵巢组织学变化:注药d18天VCD组原始卵泡消失,初级卵泡较少见,次级卵泡和窦卵泡未见明显减少,注药d37天VCD组初级卵泡偶见或消失,次级卵泡和窦卵泡总数减少至正常对照组的10.08％(8.33/82.67),其卵泡总数为正常对照组3.96％(11/278),d80天VCD组各阶段生长卵泡数严重减少(P＜0.01);d120天VCD组5只小鼠卵巢体积均明显减小(5/5),镜下见卵巢萎缩明显、皮质增厚、结构紊乱,各级卵泡消失或偶见,正常对照组和芝麻油组可见各级发育中的卵泡.
　　 3.子宫形态及组织学变化:注药d120天VCO组子宫体积萎缩、内膜变薄、腺腔小,类似于去势组子宫变化。正常对照组和芝麻油组子宫内膜较厚,固有层腺体丰富.
　　 结论
　　 1.用职业性环境化学物质VCD能成功建立卵巢早衰动物模型,实验方法简便,建模成功率高。
　　 2.本研究结果显示VCD能选择性破坏原始卵泡和初级卵泡,最终引起次级卵泡及窦卵泡的减少至消失,提示VCD作用于卵巢的靶细胞可能是原始卵泡和初级卵泡,卵巢组织学观察并未见炎型反应及坏死结构,其致卵巢早衰的机制可能是通过凋亡途径。
　　 3.用职业性环境化学物质VCD所致的卵巢早衰过程类似于女性生理性的卵巢早衰过程,这对于卵巢早衰的临床研究和治疗提供一定的帮助。
　　 4.保护女性远离卵巢毒性物质,对女性生殖健康至关重要。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:主要符号说明

前言

材料和方法

技术路线

结果

讨论

结论

附表及附图

参考文献

综述 卵巢早衰的实验性治疗的研究进展

致谢

学位论文评阅及答辩情况表