不同类型的DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究

摘要

目的：
　　 DCs在体内分化、成熟和发挥作用时常常处于不同的微环境,氧压是微环境中的重要因素。生理或病理情况下组织细胞经常处于不同氧压的微环境,如在动脉栓塞、器官移植过程中,早期局部组织是处于一种远远低于大气氧压的低氧或乏氧状态。当外界因素撤除或手术致使原本处于低氧状态的组织血流通畅,氧供随之恢复,即发生再氧合。这种乏氧-再氧合的病理生理过程,经常见于缺血再灌注损伤。那么不同氧压对DCs的分化成熟及功能有何影响?不同氧压微环境中产生的DCs对T细胞分化特别是对Treg分化有何影响?目前都尚不清楚。我们在前期研究中发现乏氧可抑制DCs的表型成熟和对T细胞的刺激功能。故本课题的目的二是在前期研究的基础上,进一步研究乏氧-再氧合条件下小鼠DCs表型及功能变化,分析再氧合DCs对Th细胞及调节性T细胞的分化影响,并对其内在分子机制进行探讨。这为解释缺血再灌注损伤的发病机制,控制器官移植的排斥反应以及肿瘤免疫治疗奠定一定的基础。
　　 总之,本课题包括两部分内容:一、同种异型DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究；二、再氧合DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究。
　　 第一部分同种异型DOs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究
　　 方法
　　 一、小鼠骨髓来源DCs的诱导
　　 1.分离C57BL/6或BALB/c小鼠的骨髓细胞,利用细胞因子GM-CSF和IL-4诱导BM-DCs。
　　 2.隔2天半量换液,第6天时给予LPS(1μg/ml)刺激24h,以诱导成熟。
　　 二、自体DCs或同种异型DCs刺激CD4+T细胞产生Treg的能力
　　 1.用免疫磁珠分离纯化BALB/c小鼠脾脏CD4+T细胞,分别与自体(同基因型)DCs或同种异型DCs共培养。
　　 2.流式细胞术(FCM)检测培养体系中CD4+CD25+Treg的比例。
　　 三、人外周血单个核细胞来源的DCs刺激CD4+T细胞产生Treg的能力
　　 1.获取不同人外周血10-15ml,分离单个核细胞(PBMC)。
　　 2.免疫磁珠法分离CD4+T细胞。
　　 3.PBMC静置2h后去除未贴壁细胞,给予重组人GM-CSF和IL-4诱导成DCs。
　　 4.将不同人的CD4+T细胞与DCs做同种异型或自体的细胞共培养。
　　 5.流式细胞术(FCM)检测培养体系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。
　　 四、增殖抑制试验检测CD4+CD25+Treg的抑制功能
　　 1.将第一步中同种异型混合淋巴细胞培养产生的Treg(generated Treg)纯化后作为抑制细胞,同种异型DCs作为刺激细胞,标记了CFSE的CD4+CD25-T细胞作为反应细胞,反应细胞:抑制细胞按照不同比例共培养。
　　 2.新鲜分离的天然Treg作为实验阳性对照,流式检测反应细胞的增殖情况。
　　 五、细胞因子在CD4+CD25+Treg产生中的作用
　　 (一)探索IL-2在同种异型DCs刺激Treg产生中的作用
　　 1.分离小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞,标记CFSE,与同种异型DCs共培养,并给予IL-2刺激,5天后FCM检测同种异型DCs对CD4+CD25+T细胞的增殖情况。
　　 2.分离CD4+CD25+T细胞,标记CFSE,然后与CD4+CD25-T细胞按照原来比例混合成CD4+T细胞整体,与同种异型DCs共培养,培养5天后收集上清,ELISA检测IL-2的水平。
　　 3.IL-2阻断试验:上述体系中加入抗IL-2的中和性抗体,对照组加入同型对照IgG,5天后流式检测CD4+CD25+T细胞的增殖情况。
　　 (二)探索TGF-β在同种异型DCs刺激Treg产生中的作用
　　 1.分离小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞,标记CFSE,与同种异型DCs共培养,不同时间后流式检测Foxp3的表达和CFSE的情况。
　　 2.收集不同时间的上清,ELISA检测TGF-β水平。
　　 3.TGF-β阻断试验:上述体系中加入不同浓度的TGF-β受体Ⅰ激酶抑制剂Ⅱ(ALK-5抑制剂Ⅱ),培养5天后检测Foxp3的表达。
　　 结果
　　 一、在无外源性细胞因子存在的情况下,小鼠同种异型DCs可刺激CD4+T细胞高效产生Treg,但自体DCs无此作用
　　 二、人同种异型DCs在没有外源性细胞因子的情况下,同样可以增加CD4+T细胞中Treg的比例
　　 三、同种异型DCs产生的Treg在体外具有抑制功能
　　 四、内源性IL-2和TGF-β在同种异型DCs刺激CD4+T细胞产生Treg中发挥重要作用
　　 结论
　　 1.小鼠同种异型BM-DCs和人PBMC诱导的同种异型DCs,在无外源性细胞因子的情况下,都可以增加CD4+T细胞中Treg的比例,产生的Treg在体外对T细胞增殖具有抑制功能。
　　 2.同种异型BM-DCs刺激的体系中,内源性IL-2和TGF-β在Treg的产生中发挥着重要的作用。
　　 创新性和意义
　　 1.首次发现同种异型BM-DCs在没有外源性细胞因子的情况下可以刺激CD4+T细胞高效产生Treg,并探讨了其机制。
　　 2.首次将CD4+T细胞作为一个整体来寻找获得足够数量Treg的方法,为优化后续研究的实验方法、制定Treg的临床治疗策略提供了一定的理论依据。
　　 研究的局限性
　　 1.同种异型BM-DCs刺激CD4+T细胞产生Treg的具体内在分子调控机制有待于进一步深入研究。
　　 2.所获得Treg应用于临床,其条件仍需进一步优化。
　　 第二部分再氧合DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究
　　 方法
　　 一、再氧合对DCs的表型影响
　　 1.分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,分别在常、乏氧条件下利用GM-CSF和IL-4诱导DCs,并给予LPS刺激。
　　 2.对乏氧条件下分化的DCs进行再氧合不同时间。
　　 3.流式检测再氧合DCs表面协同刺激分子及MHC-Ⅱ类分子的表达。
　　 二、再氧合对DCs的Th细胞增殖、分化的影响
　　 1.分离CD4+T细胞并标记CFSE,与再氧合的同种异型DCs或自体DCs共培养,后者给予抗CD3抗体刺激。
　　 2.流式检测再氧合DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力。
　　 3.收集细胞,流式检测再氧合DCs刺激CD4+T细胞的分化情况。
　　 三、再氧合影响DCs表型及功能的分子机制研究
　　 1.将乏氧下分化的DCs进行再氧合,Real time PCR的方法检测其表达四种腺苷受体的mRNA水平。
　　 2.以不同腺苷受体激动剂处理再氧合的DCs,流式检测其表型的变化。
　　 3.流式检测不同浓度A2AR腺苷受体激动剂对再氧合的DCs表型的影响。
　　 4.ELISA检测A2AR激动剂对再氧合DCs的细胞因子表达的影响。
　　 结果
　　 一、再氧合可逆转乏氧对DCs成熟表型的抑制
　　 二、再氧合DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力较乏氧DCs明显增强
　　 三、再氧合DCs降低Treg的数量而上调Th17和Th1细胞应答
　　 四、腺苷-A2AR通路在DCs乏氧-再氧合过程中发挥着重要的作用
　　 结论
　　 一、再氧合可以逆转乏氧对DCs成熟表型及功能的抑制作用
　　 1.再氧合可明显促进乏氧下分化DCs的表型成熟。
　　 2.再氧合可明显促进DCs对同种异型及同种同型抗原的递呈功能,明显增强DCs对CD4+T细胞增殖的能力,可降低Treg的数量而促进CD4+T细胞向Th17和Th1方向分化。
　　 二、腺苷受体通路参与再氧合逆转乏氧对DCs表型及功能的影响
　　 1.再氧合DCs表达高水平腺苷受体A2AR。
　　 2.A2AR激动剂CGS21680抑制再氧合逆转乏氧对DCs表型的能力,并具有浓度依赖性。
　　 3.A2AR激动剂CGS21680抑制再氧合DCs炎性细胞因子的表达。
　　 创新性和意义
　　 1.首次发现再氧合可明显逆转乏氧对DCs的成熟表型及功能的影响,这为解释缺血再灌注损伤的发病机制提供有力的证据,证明乏氧.再氧合可能是导致缺血再灌注损伤的内在机制之一。
　　 2.首次发现A2AR腺苷受体通路抑制再氧合对乏氧DCs表型及功能的逆转作用,为寻找从免疫学角度治疗缺血再灌注损伤的新策略提供新思路。
　　 研究的局限性
　　 1.腺苷通路参与再氧合促进乏氧DCs表型及功能成熟的内在分子机制仍需进一步研究。
　　 2.腺苷受体激动剂应用于治疗IRI的体内实验有待于进一步补充。

目录

文摘

英文文摘

CATEGORY

符号说明

第一部分 同种异型DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究

前言

一、调节性T细胞的分类

二、调节性T细胞的特征

三、调节性T细胞的免疫抑制机制

四、调节性T细胞的扩增

五、调节性T细胞的诱导

六、研究目的

材料

方法

结果

一、在没有外源性细胞因子存在下,小鼠同种异型DCs可刺激CD4+T细胞产生Treg,但自体DCs无此作用

二、人同种异型DCs在没有外源性细胞因子的情况下,同样可以增加CD4细胞中Treg的比例

三、同种异型DCs产生的Treg在体外具有抑制功能

四、内源性IL-2和TGF-β在同种异型DCs刺激CD4+T细胞产生Treg中发挥重要作用

讨论

小结

第二部分 再氧合DCs在调节性T细胞产生中的作用及其机制研究

前言

一、乏氧对免疫细胞的影响

二、再氧合对免疫细胞的影响

三、与氧压变化相关的信号通路

四、研究目的

材料

方法

结果

一、再氧合逆转乏氧对DCs成熟表型的抑制

二、再氧合DCs刺激CD4+T细胞增殖的能力较乏氧DCs明显增强

三、再氧合DCs降低Treg的数量而上调Thl7和Th1细胞应答

四、腺苷-A2AR通路在DCs乏氧-再氧合过程中发挥着重要的作用

讨论

小结

附图表

参考文献

致谢

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