肝再生磷酸酶-3在肝内胆管癌侵袭转移中的作用研究

摘要

[研究背景与目的]:
　　 肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)也称为外周型胆管癌、胆管癌之肝内型,是肝内胆管被覆上皮发生的、起源于肝内二级分支以下胆管上皮的一种原发性肝癌。世界范围内统计,肝内胆管癌约占原发性肝脏恶性肿瘤的10％～15％,但近年来肝内胆管癌发病率不断增长。肝内胆管癌具有发生隐匿、恶性程度高、发展迅速、容易转移等特点,尽管诊断治疗方面已取得巨大进步,但肝内胆管癌预后仍然很差。与肝细胞肝癌相比,肝内胆管癌容易发生早期淋巴结转移,而且淋巴结转移是影响肝内胆管癌预后的重要因素。因此,早期防止淋巴结转移是改善肝内胆管癌患者预后的重要措施。
　　 肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver,PRLs)是PTP酶家族重要成员之一,该基因家族包括PRL-1,PRL-2,PRL-3三个成员,它们分别定位在6q12,1p35,8q24.3染色体上。三个成员皆为分子量20KD左右的小分子蛋白,彼此之间的同源性高达76％～87％。PRLs家族体内和体外可以被异戊二烯化,这种翻译后修饰对PRL细胞内定位很重要。在其羧基端被异戊二烯基化后,PRL分布于胞浆膜上；在游离状态下,定位于细胞核中。越来越多的证据表明PRLs,尤其是PRL-3在肿瘤细胞生长调节、分化及浸润转移中起了重要作用。
　　 PRL3是最近发现的肿瘤转移相关基因。最初研究发现 PRL-3与结直肠肿瘤转移密切相关,PRL-3在结直肠癌转移灶中高表达,在非转移性原发灶和正常黏膜上皮中呈低表达。此后,陆续研究表明PRL-3在胃癌、乳腺癌及卵巢癌转移灶中也高表达,并且与肿瘤的进展和转移相关。一些证据表明PRL3过表达是肿瘤细胞获得转移特性的关键改变点。肿瘤细胞中PRL-3高表达,体外实验发现其能促进肿瘤细胞转移迁移侵袭,体内实验发现其可促进裸鼠转移瘤形成；相反,通过RNA干扰技术下调内源性PRL-3的表达能抑制肿瘤细胞迁移侵袭并减缓裸鼠转移瘤生长。此外,研究发现肿瘤患者PRL-3过表达与患者预后负相关。PRL-3过表达的肿瘤患者生存期相对较短,这点已在胃癌、直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤中有报道。由此可见,PRL-3在肿瘤转移过程中可能起重要作用,并有望成为评价肿瘤患者的预后标志。
　　 但是,目前尚无PRL-3在肝内胆管癌中表达情况的报道,其在肝内胆管癌侵袭转移中的作用尚不明确。本研究通过免疫组化方法检测PRL-3在肝内胆管癌原发灶及淋巴结转移灶中表达情况,并分析其表达与临床病理特征包括预后的关系。同时借助于RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,以合成的PRL-3基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理肝内胆管癌HCCC-9810细胞,观察PRL-3 siRNA转染对癌细胞迁移及侵袭能力的影响,并进一步探讨PRL-3参与侵袭转移的可能机制。
　　 [方法]:
　　 1.免疫组化方法检测 PRL-3在肝内胆管癌中的表达:选取病例科存档且临床资料完整的102例肝内胆管癌原发灶及癌旁组织和相应62例淋巴结转移灶,应用免疫组化方法检测PRL-3表达,分析PRL-3表达与肝内胆管癌患者临床病理特征的关系。生存分析方法评价PRL-3表达对肝内胆管癌患者预后的影响。
　　 2.PRL-3 siRNA体外合成及对HCCC-9810细胞的干预:培养人肝内胆管癌细胞株 HCCC-9810,检测细胞株中PRL-3的表达。体外化学方法合成三条 PRL-3特异性 siRNA、阴性对照siRNA；通过脂质体Lipofectamine2000将siRNA转染入肝内胆管癌细胞HCCC-9810,并筛选出最有效的干扰片段。采用RT-PCR、western-blot分别检测转染后HCCC-9810中 PRL-3基因和蛋白的表达情况,评价干扰效果。
　　 3.PRL-3对肝内胆管癌细胞侵袭转移能力的影响及机制探讨:细胞划痕实验(Scratch wound-healing assays)检测 PRL-3干扰前后细胞迁移能力变化。Transwell体外侵袭实验检测 PRL-3干扰前后细胞侵袭能力变化。Westernblot方法检测 PRL-3 siRNA转染后MMP-7,MMP-9表达情况,探讨 PRL-3促进侵袭转移的可能机制。
　　 [结果]:
　　 1.PRL-3在肝内胆管癌中的表达:PRL-3在癌旁正常胆管组织、肝内胆管癌原发
　　 灶和淋巴结转移灶中阳性表达率依次升高,分别为0,47.1％(48/102)和80.6％(50/62),三组间相比差异有统计学意义,两两相比也有显著差异(P<0.05):且伴淋巴结转移原发灶的表达阳性率(61.3％)明显高于无淋巴结转移的原发灶(25.0％),两者之间差异有统计学意义(P<0.001)。PRL-3表达与TNM分期(P<0.001),T分级(P<0.001),血管侵犯(P=0.002),淋巴结转移(P<0.001)及CA-199水平(P<0.05)相关。生存分析(Kaplan-Meier方法)显示PRL-3表达与预后负相关,PRL-3高表达的肝内胆管癌患者总体生存率低于PRL-3表达低的患者。Cox模型多因素分析表明PRL-3表达水平是肝内胆管癌患者独立的预后标志(RR1.886,P=0.024)。
　　 2.小干扰RNA转染:RT-PCR和Western blot的方法分别在mRNA和蛋白水平检测到PRL-3在HCCC-9810肝内胆管癌细胞株高表达,为RNA干扰提供理论依据。通过脂质体Lipofectamine2000分别将特异性PRL-3 siRNA和阴性对照siRNA转染入肝内胆管癌细胞HCCC-9810。RT-PCR和Western blot检测干扰效果。空白对照HCCC-9810组、阴性对照组、脂质体对照组及PRL-3 siRNA1、2、3组PRL-3 mRNA相对表达水平分别为:0.596±0.106、0.581±0.045、0.651±0.055、0.183±0.085、0.197±0.058和0.396±0.086；相对应各组PRL-3蛋白相对表达水平分别为:0.653±0.077、0.589±0.049、0.611±0.066、0.071±0.018、0.059±0.024和0.280±0.101。结果显示三条PRL-3siRNA都能有效下调肝内胆管癌细胞HCCC-9810内源性PRL-3表达,特别是PRL-3siRNA-2抑制效果更强,我们选用PRL-3siRNA-2进行侵袭及迁移实验。与转染阴性对照siRNA组、脂质体对照组和空白对照组相比,RT-PCR和Western blot结果均显示转染PRL-3特异性siRNA-2组PRL-3表达明显降低(P<0.05),而转染阴性对照siRNA组、脂质体对照组和空白对照组PRL-3表达几乎无明显差别,实验各组的内参表达无明显变化。
　　 3.PRL-3对肝内胆管癌细胞侵袭转移的影响及机制探讨:细胞划痕实验结果:PRL-3siRNA-2组在划痕培养24h后划痕区域宽度占初始划痕区域宽度的百分比为(62.12±6.28)％,阴性对照组为(23.88±2.55)％,空白对照HCCC-9810组为(21.20±6.07)％。PRL-3siRNA-2组细胞的划痕两端距离相比明显较宽,分别与阴性对照组细胞和空白对照HCCC-9810组细胞相比均有统计学意义(P<0.05),后两者无显著性差异(P＞0.05)；说明 PRL-3 SiRNA-2转染组细胞运动迁移能力明显减弱。Transwell体外侵袭实验结果显示,PRL-3SiRNA-2组细胞侵袭能力明显减弱,穿膜细胞数为(19.40±2.30)个/HP,明显少于阴性对照组(64.00±2.73)个/HP和正常 HCCC-9810组(67.20±3.11)个/HP,差异有显著性(P<0.05)；正常 HCCC-9810组和阴性对照组无明显差异(P＞0.05)。Western blot结果显示在PRL-3 SiRNA-2转染组细胞中 MMP-7、MMP-9的表达明显低于阴性对照转染细胞、脂质体对照细胞及空白对照HCCC-9810细胞,统计学分析表明差异有统计学意义(P<0.05)；而脂质体对照组及阴性对照组与空白对照组相比,MMP-7、MMP-9的表达无明显差异(P＞0.05)。
　　 [结论]:
　　 1.PRL-3在肝内胆管癌中高表达,且转移灶中表达阳性率高于原发灶。PRL-3表达与肝内胆管癌的浸润转移相关,与预后负相关,PRL-3有望成为肝内胆管癌病人的预后标志和潜在的治疗靶点。
　　 2.PRL-3特异性siRNA能够抑制肝内胆管癌细胞HCCC-9810中内源性 PRL-3的表达,并可以明显抑制肝内胆管癌细胞的迁移侵袭能力。进一步研究发现PRL-3可能通过调控基质金属蛋白酶途径促进肿瘤侵袭转移。

目录

文摘

英文文摘

OCNTENTS

符号说明

第一部分 肝再生磷酸酶-3在肝内胆管癌中的表达及其临床意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 siRNA干扰PRL-3表达对人肝内胆管癌HCCC-9810细胞侵袭转移能力的影响及机制探讨

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

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