Levan及硫酸化levan的制备和抗肿瘤活性的研究

摘要

肿瘤是一种常见病、多发病。近年来，恶性肿瘤的发病率急剧上升，己占人类死因的第二位，是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病。研究肿瘤的防治对策是摆在全世界科学工作者面前的重要任务。肿瘤的传统治疗方式具有风险大、耗资高、药物的选择性差、毒副作用强、增加病人痛苦等特点，因此高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物已成为当今抗肿瘤药物研究开发的重要方向。目前，抗肿瘤药物正从传统的细胞毒性药物向针对机制的多环节作用的新型抗肿瘤药物发展。
　　 糖类化合物具有多种生物活性，近年来的研究发现，许多糖类还具有显著的抗肿瘤活性，且其作用机制多样，如调整机体免疫间接发挥抗肿瘤活性、影响肿瘤细胞的信号传导通路、诱导肿瘤细胞的凋亡、干扰肿瘤的血管生成、侵袭和转移等。同时，针对糖类化合物衍生物的研究显示，糖的硫酸酯等衍生物往往表现出比起母体糖更为显著的生物活性。近年来研究发现，通过调节免疫功能和抑制肿瘤血管生成而发挥抗肿瘤作用的某些新型糖类化合物，具有药效强、毒副作用小等特点，具有广泛的应用前景。
　　 Levan是一种主要由β-2，6-键连接的呋喃果糖残基作为主链，以一些β-2，1-键连接作为分支点所组成的微生物果聚糖。近年来的研究发现，levan具有抗肿瘤的活性，但是其作用机制还不清楚。本课题在前期工作的基础上，选用运动发酵单孢菌发酵产物levan作为原料，对其进行部分水解和硫酸化并加以分离，制得不同分子量和不同硫酸化程度的levan，体外实验筛选出具有免疫增强和抗肿瘤血管生成活性的组分L-1和PSL-6，并进一步研究其体内体外抗肿瘤活性。为了阐明其潜在的抗肿瘤机制，本实验通过体外实验检测了L-1和PSL-6对巨噬细胞分泌IL-12和TNF-α的影响，L-1和PSL-6对肿瘤细胞分泌血管生成相关生长因子VEGF和MMP-2的影响；通过H22荷瘤小鼠体内实验考察了L-1和PSL-6对肿瘤生长的抑制作用、脾脏和胸腺的增殖作用，ELISA测定了抗肿瘤活性相关细胞因子IL-12和TNF-α,分泌的影响，免疫组化实验测定了对肿瘤血管生成相关生长因子VEGF和MMP-2的影响。
　　 本研究取得的结果和结论有以下几个方面：
　　 1.Levan和PSL的制备和分离纯化优化运动发酵单胞菌(Z.mobilis)，发酵制得胞外多糖levan，苯酚硫酸法测得总糖含量为(76.86±2.29)％，TLC和GC单糖组分分析的结果显示，levan为一种胞外果聚糖。将levan弱酸水解后，利用SephacralＴＭS-300凝胶层析柱分离，获得相对分子质量(Mr)分分布范围不同的5个组分，初次分离的组分为L-1、L-2、L-3、L-4、L-5，凝胶层析对L－1、L-2、L-3、L-4进行二次分离，进一步纯化而获得分子量相对单一的组分。多角度激光散射技术测定分子量分别为407kD、259kD、157.79kD、22.97kD、10.89kD。
　　 采用氯磺酸.甲酰胺法对levan进行硫酸化修饰后，得到PSL混合物，经过QFF离子交换层析分离得到不同硫酸化程度的组分PSL-1、PSL-2、PSL-3、PSL-4、PSL-5、PSL-6。多角度激光散射技术测定分子量分别为6，537D、5，878D、5，097D、2，890D、1,248D、1，109D，氯化钡-明胶法测定其硫酸根含量分别为(8.38±0.91)％、(11.69±0.86)％、(18.93±0.87)％、(27.64±0.91)％、(33.37±0.86)％、（42.3±0.91）％。
　　 2.筛选具有免疫增强活性和抗血管生成活性的组分采用体外培养小鼠巨噬细胞、脾脏细胞的增殖实验筛选具有免疫增强活性的组分，结果显示，levan各组分中活性最强的是L-1，其次为L-3:PSL各组分中活性最强的为PSL-6，其次为PSL-5。采用体外培养人卵巢癌细胞SKOV3的增殖实验筛选具有抗肿瘤活性的组分，结果显示，levan各组分中活性最强的是L-2，其次为L-1:PSL各组分中活性最强的为PSL-6，其次为PSL-5。采用ELISA测定人卵巢癌SKOV3细胞VEGF的表达实验筛选具有抗血管生成活性的组分，结果显示，levan各组分中活性最强的是L-1，其次为L-3;PSL各组分中活性最强的为PSL-5，其次为PSL-4和PSL-6。综合结果选择L-1和PSL-6进行进一步的抗肿瘤活性研究。
　　 3.体外实验研究L-1和PSL-6对免疫相关因子和抗血管生成相关因子的影响采用L-1和PSL-6与小鼠巨噬细胞共培养测定细胞上清液中IL-12和TNF-α的含量，结果发现，L-1和PSL-6均具有较强的增强巨噬细胞细胞因子分泌的作用，能够调节巨噬细胞的免疫功能，且具有剂量依赖性。L-1和PSL-6对IL-12分泌的最大增长率分别为(3.46±0.19)、(5.30±0.12)倍；L-1和PSL-6对TNF-α分泌的最大增长率分别为(2.17±0.016)、(2.72±0.020)倍。L-1、PSL-6对IL-12分泌的促进作用要强于TNFα。综合L-1和PSL-6对IL-12和TNF-α的上调作用来看，L-1的作用小于PSL-6。
　　 通过L-1和PSL-6人卵巢癌细胞SKOV3分泌VEGF和表达MMP-2的研究发现，L-1和PSL-6均具有较强的抑制SKOV3分泌VEGF和表达MMP-2作用，下调了肿瘤血管生成中至关重要的血管生成因子和基质金属蛋白酶类的水平。经过24h的处理后，L-1和PSL-6对VEGF分泌的最大抑制率可以达到：（64.88±1.93）％、（44.00±0.83）％；48h后，L-1和PSL-6对VEGF分泌的最大抑制率为(77.97±1.35)％、(66.63±1.37)％:72h后，L-1和PSL-6对VEGF分泌的最大抑制率为(78.96±1.57)％、(83.31±1.86)％。L-1和PSL-6的这种抑制作用均具有剂量依赖性和一定的时效依赖性。用Westernbloting测定MMP-2的表达，结果显示，在L-1、PSL-6终浓度为50μg/mL、100μg/mL、250μg/mL和500μg/mL作用72h后，二者对人SKOV3卵巢癌细胞MMP-2表达均有明显的抑制作用，并且具有一定的量效关系。L-1与PSL-6相比，PSL-6具有更强的抑制作用。
　　 4.H22荷瘤小鼠体内试验测定L-1和PSL-6的抗肿瘤活性小鼠腋下注射H22瘤细胞，随机分组后，给予不同剂量的L-1和PSL-6，培养14d，测定荷瘤小鼠的肿瘤抑制率、瘤重/体重、脾脏指数、胸腺指数、外周血IL-12和TNF-α含量以及对肿瘤组织中VEGF、MMP-2表达的影响，进一步研究二者的抗肿瘤作用和可能的机制。结果显示，L-1和PSL-6的低、中、高剂量组均能够抑制肿瘤的生长，抑瘤率分别为：（20.5±0.14）％、(31.65±0.10)％、(39.9±0.16)％、（33.28士0.12)％、(39.34±0.07)％、(42.52±0.08)％;将肿瘤组织进行切片、HE染色后进一步观察其病理形态，镜检发现，L-1和PSL-6能显著地抑制肿瘤的生长，在肿瘤组织边缘及内部均有大量坏死区域。实验结果还发现，L-1和PSL-6均能够显著地增大胸腺和脾脏指数，显著地增加小鼠外周血中IL-12和TNF-α的含量，对小鼠免疫调节具有促进作用。L-1对促进免疫细胞的细胞因子的分泌作用更强，而PSL-6对促进免疫细胞增殖的作用更强，提示二者虽然都能够增强免疫，但是他们的作用机制存在差异。免疫组化的结果显示，L-1和PSL-6能够显著地抑制肿瘤组织VEGF和MMP-2的表达，随着给药浓度的增加，这种抑制作用增强，具有明显的剂量依赖性。同浓度下，L-1和PSL-6相比，二者的抑制作用并没有显著性的差异。
　　 5.本课题取得的主要成果：
　　 (1)首次将微生物发酵的levan进行了降解和硫酸化，分离制得不同分子量和不同硫酸化程度的L和PSL各组分。
　　 (2)筛选出具有免疫增强活性和抗血管生成活性的组分，并发现PSL也具有与levan相似的和免疫增强活性和抗血管生成活性。
　　 (3)首次发现levan和PSL具有抗肿瘤血管生成的作用，初步探讨了其作用的靶点是VEGF和MMP-2。
　　 (4)首次进行体内实验，通过检测荷瘤小鼠的肿瘤抑制率、脾脏指数、胸腺指数和对IL-12、TNF-α细胞因子以及VEGF、MMP-2表达的影响，初步探讨了levan和PSL抗肿瘤作用的机制。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

符号说明

第一章 前言

1 肿瘤与免疫调节

1.1 细胞免疫与肿瘤

1.2 细胞因子与肿瘤

2 肿瘤与血管生成

2.1 血管生成与肿瘤生长

2.2 血管生成与肿瘤转移

2.3 肿瘤血管的生成调节

3 糖类及其衍生物与肿瘤

3.1 糖类及其衍生物与肿瘤免疫调节

3.2 糖类及其衍生物与肿瘤血管生成

4 Levan和多硫酸化Levan抗肿瘤活性的分子基础

4.1 Levan的分子结构

4.2 Levan与肿瘤

5 本课题拟解决的问题

第二章 Levan发酵条件的优化及分离鉴定

1 材料

1.1 试剂

1.2 仪器

2 方法

2.1 种子的复苏与培养

2.2 发酵培养基的优化及发酵

2.3 Levan粗品除蛋白和核酸

2.4 总糖含量的测定

2.5 Levan单糖组成的分析

3 结果

3.1 种子的复苏

3.2 培养基的优化

3.3 胞外多糖的分离纯化和组成鉴定

3.4 总糖含量的测定

4 讨论

5 小结

第三章 Levan的水解和硫酸化衍生物的制备

1 材料

1.1 试剂

1.2 仪器

2 方法

2.1 粗品levan的纯化

2.2 PSL的制备

2.3 L的水解及分离

2.4 样品的理化性质的测定

3 结果

3.1 QFF分离levaan

3.2 PSL的制备

3.3 L的水解及分离

3.4 样品的理化性质的测定

4 讨论

5 小结

第四章 Levan免疫调节活性和抗肿瘤活性组分的筛选

1 材料

1.1 试剂

1.2 仪器

1.3 试剂配制

2 方法

2.1 细胞培养

2.2 小鼠腹腔巨噬细胞增殖实验

2.3 小鼠脾淋巴细胞增殖实验

2.4 肿瘤细胞抑制实验

2.5 人SKOV3卵巢癌细胞分泌VEGF的影响

2.6 数据处理

3 结果

3.1 巨噬细胞的吞噬功能测定

3.2 巨噬细胞活力的测定

3.3 不同药物处理的巨噬细胞上清液对SKOV3增殖的抑制作用

3.4 脾淋巴细胞增殖率的测定

3.5 SKOV3细胞抑制率的测定

3.6 SKOV3细胞VEGF分泌的测定

4 讨论

5 小结

第五章 Levan和PSL对免疫调节和血管生成相关因子的影响

1 材料

1.1 试剂

1.2 仪器

2 方法

2.1 L-1和PSL-6对巨噬细胞分泌IL-12的影响

2.2 L-1和PSL-6对巨噬细胞分泌TNF-α的影响

2.3 L-1和PSL-6对人SKOV3卵巢癌细胞分泌VEGF的影响

2.4 L-1和PSL-6对人SKOV3卵巢癌细胞MMP-2表达的影响

2.5 数据处理

3 结果

3.1 L-1和PSL-6对巨噬细胞分泌IL-12p70的影响

3.2 L-1和PSL-6对巨噬细胞分泌TNF-α的影响

3.3 L-1和PSL-6对人SKOV3卵巢癌细胞分泌VEGF的影响

3.4 L-1和PSL-6对人SKOV3卵巢癌细胞表达的抑制

4 讨论

4.1 L-1和PSL-6对巨噬细胞分泌细胞因子的影响

4.2 L-1和PSL-6对SKOV3分泌VEGF和MMP-2表达的影响

5 小结

第六章 Levan和PSL抗肿瘤活性的体内实验研究

1 材料

1.1 试剂

1.2 仪器

1.3 动物

2 方法

2.1 L-1和PSL-6对H22荷瘤小鼠生长的影响

2.2 瘤块的病理切片

2.3 小鼠外周血中IL-12的测定

2.4 小鼠外周血TNF-α的测定

2.5 肿瘤组织VEGF表达水平的测定

2.6 肿瘤组织MMP-2表达水平的测定

2.7 数据处理

3. 实验结果

3.1 L-1和PSL-6对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

3.2 L-1和PSL-6对荷瘤小鼠脏器的影响

3.3 L-1和PSL-6对小鼠肿瘤组织病理形态的影响

3.4 L-1和PSL-6对小鼠外周血IL-12的影响

3.5 L-1和PSL-6对小鼠外周血TNF-α的影响

3.6 L-1和PSL-6对小鼠肿瘤组织VEGF表达的影响

3.7 L-1和PSL-6对小鼠肿瘤组织MMP-2表达的影响

4 讨论

5 小结

总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

学位论文评阅及答辩情况表