人类NK细胞新功能基因HMBOX1的发现及其对NK细胞功能的调节

摘要

研究目的：
　　 人类基因组计划于1990年启动，旨在对人体23对染色体全部DNA的碱基对(约30亿)序列进行排序、对功能基因进行染色体定位、构建人类基因组遗传图谱和物理图谱。该计划于2006年全面完工，历时16年绘制出了一本精确的人类基因图谱。根据基因组图谱推算，人的基因总数有近4万，截止到目前为止被发现和得到功能阐明的只有2-3万左右，其中还有近一半功能未知。人类基因图谱这一海量信息库的建立为新功能基因的发现和研究提供了很好的研究机遇和平台。后基因组时代的组学研究从传统的“蛋白找基因”模式，渐渐转向了以“图谱找基因”，再研究蛋白功能为主要特征的反向生物学模式。例如，科研工作者们应用生物信息学方法建立基因全长ORF文库，从中筛选新功能基因；采用分子生物学方法建立组织特异性cDNA文库；通过比较生物学方法寻找正常组织或参与癌症等重大疾病发生的特异性基因，并利用这些资源建立起一些高通量筛选新功能基因的方法。其中，细胞水平的功能基因筛选和功能研究是被广泛应用的方法之一，是将含有基因过表达或敲除序列的载体转染入细胞系中，通过细胞的表型和功能变化来筛选新功能基因，并研究基因具体功能和作用机制。所以建立合适的细胞筛选平台对新功能基因的发现十分重要。
　　 NK细胞是免疫系统中和T、B细胞并列的第三大淋巴细胞，属于天然免疫系统的重要成员。NK细胞在机体中不仅具有清除肿瘤和病毒感染细胞的功能，而且可以引发和调节获得性免疫应答，参与特殊组织器官的免疫耐受状态，以及抑制移植免疫排斥等。NK细胞与T细胞由共同的祖细胞发育而来，但和T细胞的研究相比，NK细胞的发育、分化、功能调节等研究领域还存在许多空白。
　　 目前的理论认为，NK细胞的活化是由表面活化性受体和抑制性受体的协调平衡调控的，尤其是NKG2D和NKG2A之间的平衡关系。大量文献报道NKG2D及其配体在肿瘤免疫逃逸和炎症发生中有重要作用，使NKG2D在NK细胞的基础研究和NK细胞与疾病的研究领域备受关注。多方面因素可以引起NKG2D分子表达变化，但NKG2D分子在细胞内的转录调控机制却尚未见报道。
　　 本研究中，我们建立了以NK细胞系为基础的天然免疫功能基因筛选平台，候选基因是由北京中国国家人类基因组北方研究中心赠送，含有158个功能未知基因的cDNA文库。我们通过NK细胞的功能实验从中筛选出对NK细胞功能有影响的新的功能基因，并选定其中一个人转录因子HMBOX1为重点研究对象，并对其在NK细胞中的表达水平及功能进行了研究。
　　 研究方法：
　　 首先，经过多种NK细胞转染方法比较，我们选择电转方法将候选基因过表达质粒转入NK细胞系NK-92细胞中，建立稳定的过表达细胞株；通过MTT增殖实验和Cr51释放杀伤实验的初步筛选，获得多个候选基因；然后，利用流式细胞技术和分子生物学技术，分析NK细胞表面分子和NK细胞杀伤相关分子表达水平的变化，从cDNA文库中筛选出对NK细胞功能有影响的候选基因。
　　 在明确HMBOX1为重点研究对象后，首先构建HMBOX1的全长表达载体pcDNA3.1-HMBOX1-myc/his，将其通过电穿孔的方法转入NK细胞系NK-92和NKL，经G418筛选建立稳定过表达细胞株，再用MTT法测其增殖变化和NK细胞杀伤功能；通过流式细胞术检测反映NK细胞脱颗粒能力的CD107a分子表达水平；PCR方法检测NK细胞杀伤相关分子和细胞因子，包括颗粒酶(Grazyme)、穿孔素(Perforin)、IFN-γ、TNF-α、NKG2A、NKG2D和DAP10的mRNA表达水平；通过流式检测NK细胞表面分子NKG2D、NKG2A、CD54、NKp46、TRAIL和Fas ligand的表达水平；用K562细胞或NKG2D抗体交联活化NK细胞后，通过流式细胞术或ELISA方法检测IFN-γ、TNF-α和穿孔素的表达水平；用慢病毒负载的shRNA干扰NK细胞中HMBOX1的表达，反向证明HMBOX1与NKG2D的关系；通过Western blot方法检测NKG2D/DAP10信号通路重要蛋白PI3K(p85，p55)、ERK1/2和PLCγ2的磷酸化水平，及HMBOX1、NKG2D和DAP10的蛋白表达水平；应用荧光素酶报告基因实验研究HMBOX1对IFN-γ启动子序列的调控。
　　 对于HMBOX1在NK细胞中的表达调控研究，我们首先通过PCR方法比较多种造血系统细胞系之间，以及外周血单个核细胞(PBMC)和NK细胞(primary NK)中HMBOX1基因的表达水平，采用淋巴细胞分离液密度梯度离心的方法从健康人外周血中分离PBMC，再用磁珠分选的方法分离NK细胞。用RT-qPCR的方法分别检测HMBOX1在IL-2、IL-15、IL-12和IFN-α刺激活化的NK细胞中的表达情况，从中发现HMBOX1与NK细胞功能状态之间的关系。
　　 结果一：基于NK细胞的天然免疫功能基因筛选平台的建立
　　 1、基于生物信息学的系统性RT-PCR/ORFome库的建立由国家人类基因组北方研究中心采用反向基因组学方法构建。
　　 2、158个候选基因cDNA表达载体的扩增和鉴定候选基因表达质粒分别转化受体菌种扩增，提取质粒后进行PCR和限制性内切酶鉴定。
　　 3、候选基因过表达NK-92细胞株的建立转染NK-92细胞方法的选择及条件摸索，大规模NK-92基因过表达细胞株的建立及稳定筛选。
　　 4、候选基因的初步筛选转基因NK-92细胞的增殖能力及杀伤活性检测。
　　 5、候选基因的鉴定检测转基因NK-92细胞的免疫表型变化及功能基因mRNA表达水平。
　　 结果二：人转录因子HMBOX1对NK细胞功能的调节作用。
　　 1、HMBOX1过表达载体的构建从NK-92细胞中调取HMBOX1基因全长，构建过表达载体pcDNA3.1-HMBOX1-myc/his，并通过Western blot对重组载体的表达情况进行检测。
　　 2、HMBOX1基因过表达细胞株的建立及增殖能力检测通过电穿孔的方法将质粒转入NK-92和NKL细胞系，筛选建立稳定过表达细胞株，对其增殖能力进行检测发现无明显变化。
　　 3、过表达HMBOX1基因抑制NK细胞的杀伤活性杀伤实验结果显示，过表达HMBOX1显著抑制了NK-92和NKL细胞对肿瘤细胞系HepG2和K562的杀伤能力，NK细胞的脱颗粒能力也显著下降，进一步证实了HMBOX1对NK细胞杀伤活性有明显的抑制作用。
　　 4、过表达HMBOX1抑制NK细胞杀伤分子表达过表达HMBOX1显著抑制了NK细胞胞内Perforin和GZM K、GZM H的mRNA水平以及Perforin的蛋白水平表达。
　　 5、过表达HMBOX1抑制NK细胞促炎症细胞因子分泌过表达HMBOX1抑制NK细胞中IFN-γ和TNF-α的mRNA表达水平及蛋白分泌水平。荧光素酶报告基因实验证实HMBOX1抑制IFN-γ启动子活性。
　　 6、HMBOX1负调节杀伤活化性受体NKG2D的表达过表达HMBOX1抑制NKG2D蛋白在NK细胞中的表达，而对其他杀伤相关受体影响不明显。RNA干扰HMBOX1基因后促进NKG2D的表达与NK细胞的杀伤能力。
　　 7、HMBOX1负调节NKG2D/DAP10信号通路活化HMBOX1抑制NK细胞NKG2D/DAP10信号通路PI3K(p85，p55)、ERK1/2和PLCγ2的磷酸化水平，及NKG2D和DAP10的蛋白表达水平，但NKG2D和DAP10的mRNA水平无显著变化。
　　 结果三：HMBOX1基因在细胞因子活化的人外周血NK细胞中的表达分析
　　 1、HMBOX1基因在原代NK细胞中高表达新鲜分离的人外周血NK细胞中HMBOX1表达水平比人NK细胞系高出近90倍。
　　 2、细胞因子活化的原代NK细胞中HMBOX1的表达水平检测IL-2、IL-15和IL-12下调原代NK细胞中HMBOX1基因的表达；IFN-α上调原代NK细胞中HMBOX1的表达。
　　 结论及意义：
　　 首先，本研究建立了基于NK细胞的天然免疫功能基因筛选平台。根据NK细胞的生物学功能，以NK细胞增殖能力和对靶细胞的杀伤功能作为初步筛选指标，然后利用分子生物学技术对候选基因进行全面分析，包括NK细胞表面分子和杀伤相关分子的表达水平，从中选出两个对NK细胞功能有影响的新功能基因，并对其中的一个HMBOX1基因进行深入研究。
　　 通过对HMBOX1在NK细胞中的具体功能进行了深入研究发现，HMBOX1可以负向调节NK细胞表面活化受体NKG2D的表达，降低NKG2D/DAP10信号通路的活化水平，同时抑制杀伤相关分子Perforin和GZM K、GZM H的表达及IFN-γ、TNF-α的分泌水平，从而抑制NK细胞的活化和杀伤能力。这些结果证明，HMBOX1分子对NK细胞功能起负调节作用。
　　 基于上述研究，我们进一步研究HMBOX1在静息和细胞因子活化的人外周血NK细胞中表达特征，结果发现：HMBOX1在静息的人外周血NK细胞中表达水平远远高于体外培养的NK细胞系，而在IL-2、IL-15和IL-12活化的人外周血NK细胞中HMBOX1均被下调，提示HMBOX1在NK细胞中发挥稳态作用。
　　 本研究首次发现了一个对NK细胞功能以及NKG2D受体表达有负向调节作用的转录因子，初步解析了NKG2D基因在NK细胞内的转录水平调节机制和过程。通过对HMBOX1在NK中的具体功能及表达水平的初步研究表明，HMBOX1基因很可能是NK细胞负调节的重要转录因子之一，对NK细胞维持自身初始状态起到非常重要的作用。