人早孕滋养细胞与蜕膜基质细胞调节及蜕膜NK细胞功能的分子机制

摘要

妊娠是一个复杂的生理过程。从免疫学角度，妊娠是一种同种异体移植现象，流产是移植排斥的结果，在正常妊娠过程中，母体对携带父系抗原的胚胎不仅不排斥，而且通过精细的母-胎对话建立独特的母-胎界面免疫耐受微环境，允许胎儿在子宫内生长知道分娩。因此对于母-胎界面免疫耐受的研究对于人类自然流产等妊娠疾患的防治具有重要意义。
　　母-胎界面主要包括滋养细胞、蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞以及免疫细胞。其中70％以上的蜕膜免疫细胞为CD56brightCD16-NK细胞。本研究通过解析母-胎界面功能细胞对外周和蜕膜NK细胞功能性发育过程，以及CXCL12/CXCR4信号在其中的调节作用，以探讨母-胎界面NK细胞功能调控的机制。
　　第一部分人外周NK与蜕膜腿的功能表型
　　目的评价外周NK与蜕膜NK的表型及功能差异
　　方法收集正常非孕育龄期妇女外周血，正常早孕妇女蜕膜组织，采用流式细胞术分析外周及蜕膜免疫细胞中NK细胞的表型、细胞因子的表达以及细胞毒活性。
　　结果相对于蜕膜NK细胞，外周NK细胞高表达激活性受体CD16，NKp44，低表达抑制性受体KIR2DL1;高表达Th1型细胞因子TNF-α，低表达Th2型细胞因子IL-4、IL-10;穿孔素表达和细胞毒活性高于蜕膜NK细胞。
　　结论外周NK细胞呈现激活表型，而蜕膜NK细胞呈现抑制表型。
　　第二部分人早孕滋养细胞和蜕膜基质细胞调节外周及蜕膜NK细胞表型及功能
　　目的解析人早孕母-胎界面功能细胞对外周及蜕膜NK细胞表型及功能的调节作用
　　方法滋养细胞、蜕膜基质细胞或滋养细胞与蜕膜基质细胞共培养体系与外周NK细胞、蜕膜NK细胞共培养，流式细胞术分析NK细胞的表型和细胞因子的表达，细胞毒性检测试剂盒检测NK细胞的细胞毒活性。
　　结果早孕滋养细胞和蜕膜基质细胞对外周NK细胞的趋化因子受体CXCR4和CCR2表达没有明显影响，而二者均显著降低蜕膜NK细胞表面趋化因子受体CCR2的表达(P＜0.05);尽管滋养细胞对蜕膜NK细胞CXCR4的表达没有影响，蜕膜基质细胞单独即可上调蜕膜CXCR4+NK细胞百分率(P＜0.05)。母-胎界面滋养细胞显著下调外周NK细胞CD16分子的表达(P＜0.05)。滋养细胞、蜕膜基质细胞单独或联合均可下调外周NK细胞杀伤性受体NKp44的表达。滋养细胞显著下调外周与蜕膜局部NK细胞Th1型细胞因子TNF-α的表达;滋养细胞与蜕膜基质细胞单独或共培养均不能改变外周或蜕膜局部NK细胞的IFN-γ的表达水平。滋养细胞显著上调外周及蜕膜局部NK细胞Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达;而蜕膜基质细胞可促进蜕膜NK细胞的IL-4与IL-10的表达水平，但对外周NK细胞Th2型细胞因子的表达没有明显影响。滋养细胞能够降调节外周及蜕膜局部NK细胞穿孔素perforin表达与其细胞毒活性;蜕膜基质细胞可降低外周NK细胞的细胞毒活性，但对perforin的表达没有影响。蜕膜基质细胞也不影响滋养细胞对NK细胞的调节作用。
　　结论母-胎界面功能细胞能够诱导外周及蜕膜NK细胞的耐受表型及Th2型优势，下调外周及蜕膜NK细胞的细胞毒活性，从而有利于形成母-胎界面免疫耐受微环境。
　　第三部分 CXCL12/CXCR4信号参与滋养细胞和蜕膜基质细胞调节外周及蜕膜NK细胞的功能
　　目的解析CXCL12/CXCR4调节母-胎界面功能细胞对外周及蜕膜NK细胞功能的调节机制
　　方法 ELISA方法检测人早孕滋养细胞及蜕膜基质细胞分泌CXCL12。检测人重组CXCL12，以及人早孕滋养细胞及蜕膜基质细胞上清液对外周NK细胞的调节作用。CXCR4拮抗剂预处理外周NK及蜕膜NK细胞，再与母-胎界面功能细胞共培养，流式细胞术分析NK细胞的表型和细胞因子的表达，细胞毒性检测试剂盒检测NK细胞的细胞毒活性。
　　结果母-胎界面CXCL12主要由人早孕滋养细胞分泌，CXCL12以剂量依赖性抑制外周NK细胞的穿孔素表达与杀伤活性，这种作用可被CXCR4拮抗剂所逆转。阻断了CXCL12/CXCR4信号通路，能够抑制人早孕母-胎界面滋养细胞与蜕膜基质细胞对外周及蜕膜NK细胞的表面受体、细胞内细胞因子以及杀伤活性的调节作用。
　　结论早孕母-胎界面功能细胞对外周NK及蜕膜NK的调节作用主要由SDF-1/CXCR4信号通路介导。
　　第四部分 MAPK信号通路参与滋养细胞和蜕膜基质细胞对外周NK细胞功能的调节作用
　　目的解析母-胎界面功能细胞调节外周NK细胞功能的下游信号通路
　　方法将分离的pNK分别用JUNK1/2/MAPK信号通路阻断剂SP600125，P38/MAPK信号通路阻断剂SB202190，ERK/MAPK信号通路阻断剂U0126预处理2小时，然后加入Tro-NK，DSC-NK，Tro-DSC-NK共培养体系，流式细胞技术分析NK细胞表型、细胞内细胞因子的表达。
　　结果 JUNK1/2/MAPK、ERK/MAPK信号通路抑制原代滋养细胞，蜕膜基质细胞对NK细胞表面受体、细胞内细胞因子的调节作用。P38/MAPK不参与原代滋养细胞，蜕膜基质细胞对NK细胞的调节作用。
　　结论 MAPK信号通路参与母-胎界面功能细胞对外周NK细胞功能的调节作用。

目录

摘要

前言

第一部分 人外周与蜕膜NK的功能表型

材料和方法

结果

讨论

第二部分 人早孕滋养细胞与蜕膜基质细胞调节外周及蜕膜NK细胞的表型与功能

材料和方法

结果

讨论

第三部分 CXCL12／CXCR4信号参与滋养细胞和蜕膜基质细胞调节外周及蜕膜NK细胞的功能

材料和方法

结果

讨论

第四部分 MAPK信号通路参与滋养细胞和蜕膜基质细胞对外周NK的调节作用

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

附录1 英文缩略语

附录2 博士期间发表的论文和论著

母胎免疫耐受的研究进展

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