基于近红外光谱分析技术的透明质酸分子量及含量快速检测研究

摘要

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是由重复双糖单位连接组成的链状聚合物，是细胞外基质的重要成分。由于其独特的黏弹性和生理功能，已被广泛应用于医药、美容、医用功能性材料和保健食品等方面。分子量和含量是表征透明质酸的两个重要参数，不同分子量的透明质酸具有不同的理化性质，决定了其具有不同的用途。目前发酵法是工业生产透明质酸的主要方法。发酵液中透明质酸含量是发酵过程的一个重要指标，含量的准确测定不仅对筛选透明质酸高产菌株至关重要，而且对实际生产中发酵工艺优化及过程控制也具有重要的意义。目前测定透明质酸分子量和含量的方法均耗时耗力，不利于实验室的快速放行和发酵过程的实时在线监测。
　　 本课题以透明质酸精品和透明质酸发酵液为研究对象，采用近红外光谱(near infrared spectroscopy, NIRS)分析技术结合化学计量学算法，建立透明质酸精品分子量模型和发酵液中透明质酸含量模型，实现这两个参数的快速无损测定。具体研究内容如下：
　　 1目前NIRS技术应用于高聚物分子量测定尚无确切的理论研究基础，而且发酵液中透明质酸含量往往在百分之一以下，属于微量分析的范畴，因此首先对应用NIRS技术建立透明质酸分子量模型和低浓度环境中透明质酸含量模型的可行性进行分析，实验结果证明NIRS技术应用于这两参数的快速测定具有实际可行性。
　　 2采用干热法降解得到一组具有一定分子量梯度的透明质酸固体粉末，将采集到的降解样品的漫反射光谱与特性黏度法得到的分子量数据进行关联，采用PLS算法建立分子量的近红外分析模型。建模过程中，对光谱预处理方法进行选择，并采用相关系数法对光谱区间进行优化。为综合考虑相关系数和均方根误差的大小，引入目标函数的概念进行模型评价。最终在1452-1542nm，1658-1848nm，1952-2048nm，2218-2300nm的光谱范围内，采用MSC作为最优的光谱预处理方法建立分子量模型，得到校正集相关系数Rc=0.9847，交叉验证均方根误差RMSECV=85.06，验证集相关系数Rp=0.9946，预测均方根误差RMSEP=66.35。对建立的分子量模型进行重复性考察，重复测定的所有方差属于同一总体，重复性结果良好，能够满足应用需要。对不同的一级分析方法和建模算法对模型的影响进行考察，结果显示分子量的统计学意义及一级分析方法准确度均对模型产生影响，且黏均分子量和重均分子量都适合建立线性模型。
　　 3取发酵条件一致的7个批次透明质酸发酵液，采集其近红外透射光谱，并将光谱与咔唑法测得的发酵液中透明质酸含量进行关联，建立发酵液中透明质酸含量的近红外分析模型。建模过程中，对光谱预处理方法进行选择，并对建模光谱区间进行考察。为综合考虑相关系数和均方根误差的大小，引入目标函数的概念进行模型评价。最终在7312.7-10000cm-1的光谱范围内，采用一阶导数Norris5点平滑作为最优的光谱预处理方法建立发酵液中透明质酸含量模型，得到Rc=0.9951，RMSECV=0.223，Rp=0.9809，RMSEP=0.376。对发酵液中透明质酸含量模型进行子模型一致性考察，结果证明不同的样本集划分仍能达到一个较优的结果。
　　 4由于时间有限，仅对NIRS技术应用于透明质酸发酵过程多参数同时测定及发酵过程控制进行了工艺设计。