厄罗替尼联合塞来昔布阻断EGFR和COX-2信号途径抑制肺癌A549细胞增殖

摘要

目的:国内外研究报道非小细胞肺癌组织(NSCLC)常有EGFR和COX-2高表达,并常与肺癌发生、发展、侵袭和转移等生物特性有密切关系。本研究探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂厄罗替尼(Erlotinib)联合环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布(Celecoxib)联合干预肺腺癌A549细胞后是否具有协同杀伤作用,并对其机制进行初步研究,从而为非小细胞肺癌治疗提供新的思路。
　　 方法:厄罗替尼、塞来昔布单独或联合干预细胞48h后,倒置相差显微镜观察细胞形态;四甲基偶氮唑盐(MTT)测定细胞抑制率;Hoechst33258法、TUNEL和AnnexinV/PI法检测细胞凋亡和流式细胞术检测细胞周期;免疫荧光检测EGFR和COX-2蛋白表达。实验数据以-x±s表示,用SPSS11.5软件进行t检验、X2检验和方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、倒置相差显微镜下形态学观察
　　 ①未加药的正常A549设为空白对照组:细胞形态正常,细胞紧密贴壁,边界清楚透明度高,生长旺盛,可见各期核分裂相。
　　 ②50μmol/L厄罗替尼单药组:细胞体积明显缩小,细胞间隙增大,细胞贴壁减慢,胞内出现颗粒,可见细胞碎片。
　　 ③25μmol/L塞来昔布单药组:细胞略变圆缩小,空泡和颗粒增多,形态改变,细胞间隙增大。可见少量的凋亡小体。
　　 ④50μmol/L厄罗替尼+25μmol/L塞来昔布联合用药组:相比单药组细胞明显皱缩变圆脱落,颗粒增多开始碎解,见细胞碎片和凋亡小体。
　　 2、四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测药物对细胞生长的抑制作用:厄罗替尼和塞来昔布单独或联合应用后,应用MTT检测生长抑制率提示两者分别对A549细胞的杀伤效应呈剂量依赖性和时间依赖性。单药厄罗替尼(50μmol/L)、塞来昔布(25μmol/L)作用48小时的细胞抑制率依次为(34.35±2.77)％、(26.66±2.12)％,厄罗替尼(50μmol/L)联合塞来昔布(25μmol/L)组抑制率为(50.33±3.27)％明显高于单药组。
　　 3、药物联合治疗后的凋亡效应:Hoechst33258染色法结果显示:空白对照组核形态均匀,未见边聚现象,胞内染色均一,形状规则,细胞联系紧密。而药物处理组均见细胞缩小,形态异常,胞质染色较深,荧光增强、染色质浓缩、碎片,可见凋亡小体形成。对照组的凋亡率为(0.78±0.04)％;而联合用药组凋亡率为(63.37±2.12)％,显著高于单用厄罗替尼组的(32.56±1.67)％和塞来昔布组的(25.67±1.98)％。
　　 TUNEL染色法:凋亡阳性细胞的判断:凋亡细胞表现为细胞胞核呈棕黄色着色,细胞浆不着色。实验中加药组均可见凋亡阳性细胞,联合加药组凋亡现象显著。对照组的(0.95±0.24)％,联合用药组细胞凋亡率为(42.13±1.4)％显著高于单用厄罗替尼组的(32.56±1.67)％和塞来昔布组的(25.67±1.98)％。
　　 Annexin V/PI法结果显示:正常对照组早期凋亡率为(0.86±1.3)％,50μmol/L厄洛替尼联合25μmol/塞来昔布处理A549细胞48h后,可见(52.47±2.3)％的细胞凋亡,明显高于50μmol/L厄洛替尼、25μmol/塞来昔布单独用药的细胞凋亡率分别为(30.24±1.7％)、(22.13±1.2)％。
　　 4、药物对细胞周期的影响:厄罗替尼、塞来昔布均可以阻滞细胞周期,引起G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少。与单药组相比,联合用药组G0～G1期阻滞作用明显。
　　 5、免疫荧光法检测药物对细胞EGFR和COX-2蛋白的影响:A549细胞中EGFR和COX-2均有表达。空白对照组EGFR和COX-2荧光很强,可见两者在A549细胞中均高表达。厄罗替尼及塞来昔布单药组EGFR和COX-2表达均减弱,而联合用药后EGFR和COX-2表达均显著减弱,具有统计学意义。
　　 结论:厄罗替尼与塞来昔布联合应用具有协同抑制细胞生长,介导细胞凋亡作用,机制可能与两者均可阻滞细胞周期于G0/G1期及阻滞EGFR和COX-2信号途径有关。