人乳头瘤病毒58型(HPV58)E2蛋白与E7蛋白的直接相互作用及效果研究

摘要

目的和意义:人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）属乳多空病毒科A组，为嗜上皮组织的小DNA病毒。目前，人们已经成功分离出了120多个型别的HPV。根据致病性的不同，又可将其分为低危型和高危型。低危型包括HPV-1、2、6、11等，主要引起良性瘤或疣，如扁平疣和尖锐湿疣;高危型包括HPV-16、18、31、45、58等，可以导致恶性肿瘤，是宫颈癌的主要病因之一。
　　 HPV-58是一种重要的高危型HPV，它的流行存在地域差异。流行病学研究表明，HPV-58的感染主要分布在亚洲，尤其是东亚地区，因此欧美学者对其关注较少。我国各地区的流行病学调查显示，无论在宫颈筛查，还是宫颈癌患者中，HPV-58的感染率都仅次于HPV-16和18，有些地区甚至超过HPV-18。但是对HPV-58的病毒生物学及致癌活性的研究却远远落后于HPV-16和18。目前，针对HPV-16和18型病毒的疫苗已经上市，但却不能保护HPV-58的感染。因此，对HPV-58的研究具有很强的现实意义。
　　 HPV基因组全长8kb左右，可分为3个区:长调控区(longcontrolregion，LCR)、早期基因区（编码早期调控蛋白E1、E2、E4、E5、E6、E7）和晚期基因区（编码衣壳蛋白L1和L2）。E6和E7是主要的癌蛋白，其致癌机制已经比较清楚，且功能较为保守。而E2蛋白是病毒的转录调控蛋白，功能较为复杂，不仅可以调节E6和E7的转录，还可以和多种宿主蛋白相互作用。最引人注目的是E2蛋白可以抑制E6/E7的表达，从而抑制细胞的恶性转化，但在病毒基因组整合的过程中，常伴随E2基因的破坏，特别在宫颈癌组织中E2常常缺失。因此，E2蛋白的缺失被认为是宫颈损伤由良性转为恶性的关键转折点。然而，E2的功能较复杂，目前还不是清楚其在病毒生活周期中究竟扮演什么角色。其研究结果也主要来自于HPV-16E2和BPVE2。
　　 因此，本研究以HPV-58E2蛋白作为研究对象，试图深入了解58E2蛋白在抑癌方面的分子机制，为进一步研究基于E2蛋白的宫颈癌治疗性疫苗奠定实验基础。
　　 方法和结果:本研究应用GST-pulldown发现了HPV-58E2蛋白可以和E7蛋白在细胞外结合，并应用免疫共沉淀进一步验证二者在细胞内的直接相互作用。同时，我们还发现，E2和E7蛋白在细胞内的结合具有HPV型别特异性，即58E2只能与58E7结合，却不能结合16E7;同样，16E2也只能和16E7结合，但不能结合58E7。为了进一步确定58E2和E7结合的结构域，我们构建了一系列58E2的截短型突变体，应用免疫共沉淀分别检测它们与58E7是否存在直接相互作用，结果发现，58E2的N端和C端都不能结合58E7，只有中间的铰链区，特别是其中244-254aa是58E2和58E7结合的关键部位。
　　 在此基础上，我们进一步研究了58E2和58E7的结合对58E7致癌活性的影响。因为HPVE7蛋白结合并降解抑癌蛋白pRb是其致癌的主要机制之一，所以首先检测了58E2是否会抑制58E7对pRb的降解。我们应用E2全长蛋白和58E2的各截短型突变体分别和58E7共转染HaCat和NIH3T3细胞，检测细胞中pRb的稳定水平。结果证明不仅58E2全长蛋白可以抑制pRb的降解，包含铰链区的58E2各截短型突变体都可以不同程度地保护pRb不被58E7降解。接下来又通过免疫共沉淀法检测58E2和58E7相互作用是否会抑制58E7与pRb的结合，分别用58E2NT和缺失pRb结合位点的58E7突变体58E7△22-26作为对照。结果显示，野生型58E7和58E7△22-26结合58E2的能力无明显差别，而58E2不会抑制58E7与pRb结合。此外，我们还通过细胞克隆形成实验检测了58E2对58E7诱导的细胞增殖活性的影响。结果发现，包含铰链区的突变体和全长58E2都可以抑制58E7诱导的细胞增殖。
　　 结论:①HPV-58E2和E7蛋白存在直接相互作用，58E2铰链区是结合58E7的关键部位;②E2-E7的结合表现出HPV型别特异性;③HPV-58E2蛋白抑制58E7介导的pRb的降解，进而抑制58E7诱导的细胞增殖活性。

目录

声明

符号说明

第一部分 人乳头瘤病毒58型(HPV-58)E2蛋白与E7蛋白的直接相互作用及效果研究

摘要

1 前言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

第二部分 卡波氏肉瘤相关病毒(KSHV)被膜蛋白ORF45脂筏定位在病毒组装释放中的功能研究

摘要

1 前言

2 材料和方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

附图(supplementary figure)

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