野生型及突变型乙型肝炎病毒X基因的克隆、表达、纯化及免疫鉴定

摘要

研究背景及目的:
　　 乙型肝炎病毒(HBV)感染是影响全球人类健康的重要疾病，HBV慢性感染是形成人类肝细胞癌的主要致病因素。HBV基因组含有4个开放读码框架(openreadingframe，ORF)，即S、C、P和X区。其中，X区在HBV基因组的第1374-1838位核苷酸，长约465个碱基，是HBV基因组中最小的ORF，其编码的x蛋白(即乙型肝炎病毒x抗原，HBxAg)与乙型肝炎肝硬化(以下简称为乙肝肝硬化，livercirrhosis，LC)、原发性肝细胞癌(Primaryhepatocellularcarcinoma，HCC)的发生具有明显的相关性。由于HBV复制体系独特，在慢性感染者免疫压力等因素作用下，HBV经常发生突变。研究发现由HBV导致的HCC患者体内的HBV突变率比无症状携带者(asymptomaticcarrier,ASC)体内病毒突变率明显增高，其中最常见的突变类型是A1762T/G1764A双突变。由于A1762T/G1764A双突变位于核心启动子(corepromoter,CP)编码区，目前许多学者认为A1762T/G1764A双突变在一定程度上影响到CP的活性。但是，由于HBV基因组中编码区具有高度重叠性，A1762T/G1764A双突变正好引起了HBxAg第130位和131位氨基酸的改变。这种改变很可能会导致HBV蛋白结构和功能的变化，继而影响到HBV相关性肿瘤的发生和疾病的进展。因此，我们构建野生型和A1762T/G1764A双突变型乙型肝炎病毒X基因原核表达系统，表达并纯化2种抗原，即HBxAg-野生及HBxAg-突变，同时制备2种抗原相应的兔抗血清，为深入研究HBVX基因及其双突变后对HBV慢性感染者病情发展和肿瘤发生的作用奠定基础。
　　 方法:
　　 从慢性乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA，经PCR扩增和基因测序，证实并获得野生型及A1762T/G1764A双突变型HBVX基因。应用TA克隆及亚克隆技术将2基因分别插入pGEX-6P-2载体，构建pGEX-6P-2-HBVXw(野生型)及pGEX-6P-2-HBVXm(A1762T/G1764A双突变型)重组表达载体;转化入宿主菌进行诱导表达;包涵体复性后，GSTrapFF蛋白纯化柱纯化带有GST标签的野生型和A1762T/G1764A突变型HBVx抗原(HBxAg);应用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA方法对表达的野生型和双突变型HBxAg进行鉴定;分别制备兔抗HBxAg-野生及HBxAg-突变多克隆抗体(HBxAb-野生，HBxAb-突变)，应用ELISA方法对2种抗体分别鉴定;用HiTraprProteinAFF纯化柱纯化兔HBxAb多克隆抗体。
　　 结果:
　　 1.SDS-PAGE证实本研究构建的2个表达系统均能高效表达目的蛋白;
　　 2.复性、纯化后野生型和双突变型GST-HBxAg浓度分别达到4.88mg/ml和5.07mg/ml;
　　 3.Westernblot鉴定证实所纯化的野生型和双突变型HBxAg均能被同一种特异性的单克隆抗体所识别，提示2种重组抗原具有相似的抗原性;
　　 4.ELISA方法检测显示2种抗原都能成功包被于微量滴定板上并与乙肝患者血清反应;
　　 5.ELISA方法证实本研究制备的兔多克隆HBxAb-野生及HBxAb-突变均能特异地识别野生型和双突变型HBxAg。
　　 结论:
　　 本研究成功地构建了野生型和A1762T/G1764A双突变型HBVX基因表达系统，成功制备了兔抗HBxAg-野生及HBxAg-突变的多克隆抗体，为进一步研究A1762T/G1764A双突变对肿瘤发生学和慢性HBV感染者疾病进展的作用和分子机制奠定了基础。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

一、实验材料与仪器

二、实验方法

结果

1．野生型及双突变型HBV X基因PCR结果

2．重组质粒酶切鉴定结果

3．野生型及A1762T／G1764A双突变型HBV X基因测序结果

4．诱导HBxAg(野生型及突变型)表达

5．HBxAg(野生型及突变型)的纯化

6．Western blot对融合蛋白的鉴定结果

7．ELISA实验鉴定结果

8．ELISA实验鉴定兔抗-HBxAg多克隆抗体

9．兔抗-HBxAg多克隆抗体纯化效果图

附录

讨论

结论

参考文献

致谢

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