丁内酯衍生物3BD0通过降低脑内Aβ含量改善了APP/PS1双转基因模型小鼠的认知障碍

摘要

目的:
　　 阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)是临床的常见病，多发病。至今没有有效的治疗药物。细胞外β淀粉酶(Aβ)过度沉积是AD的一个标志性病理产物。而且越来越多的证据显示，自噬在Aβ代谢和AD发病中发挥一定的作用。我们近期发现，一种丁内酯衍生物3BDO可以抑制细胞内自噬泡聚积并保护细胞免受Aβ的细胞毒性作用。在此，我们利用一种成熟的阿尔茨海默氏病(AD)动物模型——APP/PS1双转基因小鼠，研究丁内酯衍生物3BDO对Aβ代谢的作用，长期抑制自噬对AD的影响，从而探讨3BDO在治疗AD中的作用。以期为我们研究治疗和预防AD提供了有益的参考。
　　 方法:
　　 1.3BDO为脂溶性药物。将3BDO溶于DMSO中，浓度为200mg/ml。
　　 2.用6月龄APP/PS1双转基因小鼠为模型，分为三组。采用微量注射器腹腔注射的方式给药。对照组（腹腔注射NaCl），溶剂对照组（腹腔注射DMSO），实验组，腹腔注射3BDO。注射剂量为80mg3BDO/kg小鼠体重，每只小鼠每天注射一次。平均每只小鼠注射药物量为10ul。注射持续10周。
　　 3.采用morris水迷宫进行小鼠的行为学检测。全过程包含1天适应期（没有平台），5天寻找隐藏平台的学习实验，以及学习实验24小时后，外加一天的探索实验。在学习实验中，每一次实验，小鼠游泳寻找隐藏平台的时间最多为60s。如果在60s内，小鼠没有找到平台，则将小鼠引导到平台上。每只小鼠每天训练4次。平台位置在SW西南象限，起始位置为N(north)、E(east)、SE(southeast)、NW(northwest)。每天随机使用该四个位置的一个位置，以防止小鼠不是根据平台位置去找寻平台，而是根据特定的左右转向定位平台位置。动物找寻并爬上平台的时间被定为潜伏期。最后一次学习实验结束后24h，移除平台进行探索实验，用以检测记忆能力。探索实验中，采用新的起始位置（东北），而且每次实验的时间为60s。
　　 在探索试验中，动物穿越原先平台的位置次数，被用来评估学习任务的优劣。所得数据采用重复数据的方差分析和多元方差分析。
　　 4.用硫磺素硫及免疫组化的方法，观察小鼠脑片老年斑沉积的数量及面积。用Elisa定量分析脑内的Aβ40及Aβ42的含量。综合二者结果，确定3BDO治疗之后，APP/PS1小鼠脑内的老年斑数量及Aβ的含量变化。
　　 5.采用免疫印记Westernblot定量观测小鼠脑内与自噬有关的蛋白(LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ，自噬底物蛋白P62等)的含量变化，同时检测与自噬相关的mTOR信号的底物分子——磷酸化的P70的含量，来确定3BDO对自噬及mTOR信号的影响。同时用透射电镜观察小鼠皮层中神经元中的自噬泡数量。来共同确定3BDO对小鼠脑内自噬水平的影响。
　　 6.采用免疫印记Westernblot定量观测小鼠脑内与Aβ代谢相关性最大的β分泌酶及Aβ降解酶的含量变化。同时检测Aβ的前体物质—APP的含量。BACE1是剪切生成Aβ的关键酶，而NEP(neprilysin)、IDE(Insulindegradationenzyme)是两个最关键的Aβ降解酶。联合分析APP、BACE1、NEP、IDE的变化，可以探索3BDO导致Aβ减少的相关机制。
　　 采用抗体免疫捕获的方法将降解酶NEP、IDE从组织液中分离出来，通过激活特异性荧光底物Mca-RPPGFSAFK-OH的量来检测NEP与IDE的活性。
　　 结果:
　　 1.注射后动物无死亡，各组之间体重没有明显差异。说明3BDO具有良好的安全性。
　　 2.3BDO改善了APP/PS1小鼠的学习和记忆能力。在8月龄时，水迷宫实验发现，APP/PS1小鼠已经具有明显的学习和记忆损害。而经过3BDO处理的转基因小鼠，学习和记忆能力则明显提升。相对于对照组，实验组(3BDO)小鼠潜伏期明显缩短，而探索实验中穿越平台的次数和花在平台所在象限的时间，均明显增加。这提示3BDO治疗可以明显改善APP/PS1小鼠的学习和记忆能力缺陷。
　　 3.3BDO治疗明显减少了APP/PS1转基因小鼠脑内淀粉样斑块的形成和可溶性Aβ的水平。结果发现，实验结束后，8月龄小鼠脑内均观察到了明显的Aβ沉积。与对照组相比，3BDO治疗后，明显降低了APP/PS1转基因小鼠海马和皮层的Aβ沉积。通过ELISA试剂盒定量检测全脑可溶性Aβ的含量发现，相对于对照组，治疗组的Aβ40和Aβ42水平均明显减少。这说明3BDO减少了APP/PS1小鼠脑内的Aβ水平。
　　 4.自噬3BDO抑制了APP/PS1小鼠脑内的自噬水平，而抑制自噬是经由激活mTOR蛋白实现的。WB结果发现，3BDO治疗后，相对于对照组而言，LC3-Ⅱ的量明显减少。与此相应的是，自噬底物P62的含量则升高了。这表明长时间的3BDO治疗抑制了APP/PS1小鼠脑内的自噬流。通过检测mTORCl磷酸化激活底物p70S6K(P70)的含量发现，相对于对照组（DMSO和NaCl），3BDO治疗明显增加了p70的含量，因此，这意味着3BDO是通过激活mTOR途径而抑制了自噬。通过透射电镜计数神经元内自噬泡的含量，我们也发现，3BDO治疗明显减少了神经元内自噬泡的数量，改善了神经元的功能。
　　 5.3BDO治疗增加了转基因小鼠脑内NEP和IDE的水平。3BDO治疗后，APP/PS1小鼠脑内的APP的表达量、β分泌酶BACE1的含量，以及β分泌酶剪切APP生成的C-末端产物，均没有明显改变。然而，两个Aβ降解相关的酶，NEP和IDE，在3BDO治疗后，均明显增加了。而且NEP酶的活性增加也非常明显。这提示我们，3BDO治疗后APP/PS1小鼠脑内Aβ含量的降低很可能是源于Aβ降解的增高所致。
　　 结论:
　　 综上，我们在此进一步探讨了3BDO治疗能否阻止或者延迟转基因小鼠的AD进展。我们发现，长时间3BDO治疗提高了Aβ降解酶IDE和NEP的含量，增加了NEP酶的活性，抑制了自噬水平（通过mTOR途径），减少了脑内Aβ的含量，改善了APP/PS1痴呆小鼠的行为学表现。而且，治疗期间未见动物死亡，说明3BDO具有一定的安全性。因此，我们的实验结果证明了，长时间应用3BDO对与治疗AD具有有益的作用。这对研究自噬的生物学功能和在AD中的潜在机制，以及治疗AD都可以提供一个良好的工具。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．实验动物与分组

2．主要试剂和仪器

3．主要实验方法

结果

1．3BDO具有良好的安全性

2．3BDO改善了APP／PS1小鼠的学习和记忆能力

3．3BDO治疗明显减少了APP／PS1转基因小鼠脑内淀粉样斑块的形成和可溶性A β的水平

4．3BDO治疗增加了转基因小鼠脑内A β降解酶NEP和IDE的水平

5．3BDO通过激活mTOR信号抑制了APP／PS1小鼠脑内的自噬水平

讨论

1．靶向A β降解的化学小分子3BDO为治疗AD提供了新思路

2．在AD晚期抑制自噬可以起到一定保护作用

3．靶向提高A β降解酶的活性或者含量有助于改善AD患者脑内的A β和AD模型小鼠的认知行为学

结论

附图

参考文献

致谢

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