RNA干扰和洛拉曲克对大肠癌LoVo细胞胸苷酸合成酶表达及细胞增殖的影响

摘要

背景与目的:大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来该病发病率有增高的趋势，其中手术切除仍然是治疗大肠癌最有效的方法。化疗作为手术后的辅助治疗同样发挥着重要的作用，但是在化疗过程中产生的对化疗药的耐药性成为肿瘤治疗的难题。洛拉曲克是一种新型胸苷酸合酶(Thymidylatesynthase，TS)抑制剂，脂溶性且不含谷氨酸侧链，有利于细胞摄取，从而提高肿瘤细胞的洛拉曲克的浓度。其进入细胞后，可以干扰DNA的合成，阻止细胞分裂增殖而发挥抗肿瘤作用。目前，洛拉曲克作为新型抗肿瘤化学合成药在临床试验中已证实其对肝癌、头颈癌等实体癌有较好的疗效。研究表明，应用针对TS的化疗药时，TS的表达水平和化疗的疗效直接相关。RNA干扰(RNAi)技术是最有效的在转录后水平抑制基因表达的手段，而大肠癌的发生亦是癌基因的激活和失活共同作用的结果。研究还表明，肿瘤组织细胞中TS表达水平越高，化疗效果越差。本文的目的旨在探索洛拉曲克、化学合成的siRNA以及二者联合体外实验作用于LoVo细胞后对TS表达水平的动态变化，以及对细胞增殖的影响。从而为临床更好的提高化疗药的疗效提供理论基础。
　　 方法:靶向人胸苷酸合酶TS基因的siPAN转染至人LoVo细胞中，利用RT-PCR和WesternBlot技术观察沉默TS基因后对其基因和蛋白表达的变化。洛拉曲克体外作用于LoVo细胞，WesternBlot观察对其TS水平动态变化，MTT实验及流式细胞技术观察其对细胞增殖的影响。另联合siRNA与洛拉曲克共同作用于LoVo细胞，观察其对细胞TS蛋白及细胞生长的影响。应用SPSS18.0统计软件对数据进行分析，数据用均数±标准差((x)±s)表示;两组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。
　　 结果:
　　 1.洛拉曲克对LoVo细胞有明显的抑制作用，其IC50值约为6.31μmol/L。其可以促进细胞凋亡，凋亡率随作用时间的延长而增加。
　　 2.相同剂量洛拉曲克处理细胞后，RT-PCR结果显示，在mRNA水平，随着时间的延长，TS/GAPDH比值与对照组相比，有持续升高的趋势，但是只有48h和60h相对于未处理组有统计学意义。
　　 3.相同剂量的洛拉曲克处理细胞后，随着时间的延长，其TS蛋白的表达水平亦有持续升高的趋势。
　　 4.TSsiRNA可以显著的下调LoVo细胞中TSmRNA及蛋白的表达水平，并抑制细胞生长。
　　 5.TSsiRNA联合洛拉曲克作用于细胞相比于单独作用组，可使IC50明显降低，并且更明显的促进了细胞的凋亡。
　　 结论:
　　 1.洛拉曲克可以明显的促进细胞凋亡并可以产生TS诱导现象。
　　 2.TSsiRNA可以下调人LoVo细胞中TS基因和蛋白的表达，使细胞生长减慢，凋亡增加。
　　 3.TSsiRNA可以增强洛拉曲克的药物敏感性。联合应用TSsiRNA和洛拉曲克可以可以更好的抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡。