人参皂苷Rb1对神经内肽酶基因启动子活性的影响

摘要

阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)是一种原发进行性神经元退行性疾病，是老年性痴呆症最常见类型。研究显示β淀粉样前体蛋白酶解产生的β-淀粉样肽（β-amyloid peptide，Aβ）寡聚体是导致神经元凋亡损伤，进而导致AD病理发展的主要毒性物质之一。
　　 神经内肽酶（neprilysin， NEP）为Ⅱ型膜结合型锌依赖肽链内切酶，是脑内降解Aβ的关键酶之一。在正常情况下，NEP参与脑内低浓度Aβ的维持。在病理情况下，NEP表达水平降低，Aβ合成与清除失衡，脑内Aβ聚集。因此NEP表达水平的降低与AD的发生和发展密切相关。
　　 人参皂苷Rb1是从人参中提取的活性单体物质，是人参作用于神经系统的主要成分之一，对神经细胞有保护作用。我们先前的研究显示Rb1可以明显上调人神经母细胞瘤细胞NEP表达水平和活性。为进一步阐明Rb1促进NEP表达的机制，本研究构建了一系列NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒，用Rb1处理其转染的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，探查了NEP基因5'上游启动子区域中与Rb1影响NEP启动子活性有关的位点。
　　 实验方法:
　　 1.用限制性内切酶MluⅠ和XhoⅠ对NEP基因启动子-荧光素酶报告基因质粒pGL3-nep2.4进行酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用通用引物RVprimer3和GLprimer2对其进行序列分析;
　　 2.用pGL3-nep2.4质粒转染SH-SY5Y细胞，并用Rb1对转染细胞进行处理，检测转染细胞的双荧光素酶活性;
　　 3.用Erase-a-base System试剂盒对pGL3-nep2.4质粒插入片段进行5'端缺失突变，构建一系列NEP基因启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒，并进行XhoⅠ及BamHⅠ双酶切鉴定和DNA测序分析;将缺失体质粒分别转染SH-SY5Y细胞，检测其双荧光素酶活性;
　　 4.大量挑取NEP启动子-894 bp～-534 bp及-247 bp～-82 bp片段对应突变体库转化平板上的阳性克隆，并进行XhoⅠ及BamHⅠ双酶切鉴定和DNA测序分析;用筛选获得的前述特定范围内缺失体转染SH-SY5Y细胞，检测其双荧光素酶活性;
　　 5.用Rb1处理-894 bp～-857 bp、-559bp～-534bp、-223 bp～-179 bp及-100bp～-82 bp对应的8个缺失体转染的SH-SY5Y细胞，检测其双荧光素酶活性。
　　 实验结果:
　　 1.酶切后电泳及DNA测序结果显示pGL3-nep2.4质粒的DNA片段插入方向及序列正确;
　　 2.荧光素酶活性检测显示，转染的SH-SY5Y细胞荧光素酶活性是转染pGL3-basic的13.1倍(P＜0.01); Rb1处理可使转染pGL3-nep2.4质粒SH-SY5Y细胞荧光素酶活性增加，其是未处理的2.9倍(P＜0.01);
　　 3.酶切鉴定及序列分析结果显示， NEP启动子大范围缺失体系列插入方向及序列正确;
　　 4.特定范围缺失体系列转染细胞荧光素酶活性检测显示，NEP基因上游启动区-894 bp-857 bp(RegionⅠ)及-100 bp～-82 bp(RegionⅣ)片段缺失后，启动子活性分别是缺失前的29％(P＜0.01)和25％(P＜0.01)，-559bp～-534bp（RegionⅡ）及-223 bp～-179bp(RegionⅢ)片段缺失后，启动子活性分别是缺失前的5.12(P＜0.01)及1.81倍(P＜0.01)。
　　 5.Rb1处理后，双荧光素酶活性检测显示，RegionⅠ、Ⅱ和Ⅲ缺失前后缺失体体质粒转染细胞荧光素酶活性均与未处理的无明显差异(P＞0.05)，RegionⅣ缺失后质粒pGL3-226转染细胞荧光素酶活性也与未处理的无明显差异(P＞0.05)，而RegionⅣ缺失前缺失体质粒pGL3-244转染细胞荧光素酶活性则是未处理的1.61倍（P＜0.01）。
　　 结论:
　　 1.pGL3-nep2.4质粒中2.4 kb DNA插入片段具有较强启动子活性，且Rb1能明显增加其启动子活性;
　　 2.成功构建了NEP启动子大范围缺失体系列及2个特定范围缺失体系列;
　　 3.NEP基因2.4 kb DNA片段有2个正调控区(RegionⅠ和RegionⅣ)和2个负调控区（RegionⅡ和RegionⅢ），Rb1通过RegionⅣ发挥正调控作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptides，Aβs)与AD发病机制

神经内肽酶(neprilysin，NEP)与AD防治

人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1)

本研究概述

1．材料

1．1 细胞

1．2 质粒

1．3 主要试剂

1．4 试剂配制及处理

2．方法

2．1 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的培养

2．2 重组质粒pGL3-nep2．4的双酶切鉴定及测序质粒转化扩增

2．3 质粒转化扩增

2．4 质粒提取

2．5 细胞转染及Rb1处理

2．6 双荧光素酶活性测定

2．7 NEP启动子缺失体-荧光素酶报告基因质粒的构建

2．8 较大范围NEP启动子缺失体质粒酶切鉴定及测序

2．9 大范围缺失体质粒转染SH-SY5Y细胞及双荧光素酶活性测定

2．10 特定范围NEP启动子缺失体质粒筛选、测序及酶切鉴定

2．11 特定范围缺失体质粒转染细胞及双荧光素酶活性测定

2．12 Rb1处理特定范围缺失体质粒转染细胞及双荧光素酶活性测定

2．13 统计学分析

3．结果

3．1 质粒酶切鉴定与测序

3．2 Rb1对pGL3-nep2．4启动子活性的影响

3．3 NEP启动子缺失体报告基因质粒的鉴定

3．4 NEP启动子缺失体的启动子活性

3．5 NEP启动子调控区缺失体筛选与鉴定

3．6 Rb1对缺失体启动子活性的影响

讨论

附图

参考文献

致谢

硕士期间主要研究成果

学位论文评阅及答辩情况表