辛伐他汀通过抑制转β分泌酶HEK293细胞RhoA/ROCK途径减少Aβ42的生成

摘要

阿尔茨海默病主要发生在老年前期和老年期，临床上主要以进行性的认知功能受损和行为改变为特征表现的中枢神经系统退行性疾病。关于阿尔茨海默病的发病确切发病机制尚不明确，但目前居于主导地位并研究较为成熟的机制之一是细胞外β-淀粉样蛋白的生成和清除失衡。已往研究显示长期应用他汀类药物能够降低阿尔茨海默病的发病风险，大部分研究围绕降脂途径对β-淀粉样蛋白生成的影响，其通过降脂以外途径影响β-淀粉样蛋白的生成近年来逐渐也成为热点。研究证明非甾体抗炎药物可以通过影响细胞膜上小G蛋白RhoA的定位及下游蛋白激酶ROCK的活化，减少β-淀粉样蛋白的生成。他汀类药物除降脂外可抑制异戊二烯小分子的生成，其是Rho蛋白翻译后修饰的重要物质，而Rho蛋白只有翻译修饰后才能膜定位，发挥其信号转导功能。他汀类药物是否同样可以通过这一途径对β-淀粉样蛋白的生成产生影响，尚不明确。甲羟戊酸为胆固醇和异戊二烯小分子的前体，有文献表明，在细胞外液高胆固醇的条件下，加入低浓度的甲羟戊酸能恢复异戊二烯化途径，而不影响细胞内胆固醇含量。我们在保持细胞外液胆固醇含量充分条件下，把细胞分为对照组、他汀类药物组和他汀类药物加甲羟戊酸组，然后分析不同分组对细胞膜RhoA蛋白膜定位影响，并同时观察细胞内信号下游效应分子ROCK的激活状态。提取每组的细胞外液做β-淀粉样蛋白含量分析，观察其分泌量情况。综合上述观察他汀类药物通过RhoA/ROCK信号转导途径对细胞分泌β-淀粉样蛋白含量的影响，从而分析是否能对阿尔茨海默病起到一定的防治作用。
　　 研究目的:
　　 保证培养环境胆固醇充分条件下，观察他汀类药物通过RhoA/ROCK途径对转β分泌酶HEK293细胞分泌β-淀粉样蛋白的影响。
　　 研究方法:
　　 1.BACE1-HEK293细胞培养及实验分组:RMPI1640培养基，1OOU/ml青霉素和100μg/ml链霉素，参照文献方法给予10％的胎牛血清保证细胞培养环境胆固醇含量充足。于37℃，含5％CO2的培养箱内进行培养。培养细胞达到一定数量后，根据甲羟戊酸可恢复异戊二烯化途径和下述的MTT结果分为空白对照组、1μmol/L辛伐他汀药物浓度的处理组、1μmol/L辛伐他汀+250μmol/L甲羟戊酸药物处理组、5μmol/辛伐他汀药物处理组、5μmol/L辛伐他汀+250μmol/L甲羟戊酸药物处理组。
　　 2.MTT检测细胞活性:将细胞以每孔5×103接种于96孔板中，待细胞达到孔板中70％-80％时，如上述细胞分组处理，当药物处理细胞24h后，每孔加入MTT(5g/L)20μl，37℃孵育4h，弃去培养液，再每孔加入100μLDMSO，震荡1Omin，酶标仪（BIO-RADModel680型）于550nmol/L波长处测定吸光光度值。
　　 3.COD-PAP法测定细胞内胆固醇:待细胞长满至培养孔的80％左右后，用异丙醇提取细胞内胆固醇，以胆固醇与总蛋白的比值做为胆固醇水平。
　　 4.ELISA法检测:收集作用24小时各个处理组的上清液1mL，加入10μl的PMSF，12000rpm4℃高速离心。取上清50μl为待测样品。ELISA检测Aβ42的分泌量。
　　 5.Westernblot法检测:提取各个处理组细胞膜蛋白和细胞浆蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定提取的蛋白浓度，westernblot检测细胞膜上RhoA及细胞浆T696位点磷酸化肌球蛋白磷酸酶肌球蛋白结合亚基(p-MYPT1)表达量变化。
　　 结果:
　　 1.MTT结果表明各组细胞存活率无差异学统计意义，各个处理组药物浓度对细胞存活率影响不大。
　　 2.1、5μmol/L辛伐他汀组作用24h后细胞内胆固醇含量较对照组无明显变化。
　　 3.ELISA法显示1μmol/LSim、5μmol/LSim处理组细胞分泌Aβ42量较对照组显著减少，分别加入250μmol/LMev后能恢复至对照组水平。
　　 4.Westernblot检测出1μmol几Sim、5μmol/LSim处理组细胞膜上RhoA及细胞浆p-MYPT1含量较对照组显著降低，分别加入250μmol/LMev后能够对抗Sim的作用。
　　 结论:
　　 1.他汀类药物可以通过降低胆固醇以外的途径减少RhoA蛋白的细胞膜定位和下游激酶ROCK的活化。
　　 2.他汀类药物抑制细胞外液Aβ42的分泌量可能和RhoA/ROCK途径有关联。
　　 研究意义:
　　 本课题实验体外初步证明了他汀类药物对细胞β-淀粉样蛋白的代谢途径有影响，可能与RhoA/ROCK信号转导通路有关，进一步为AD的治疗提供理论依据。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1 主要材料与试剂

2 实验仪器

3 实验步骤和方法

实验结果

1．辛伐他汀和甲羟戊酸对细胞存活率的影响

2．辛伐他汀对细胞内总胆固醇含量的影响

3．辛伐他汀对细胞外液Aβ42分泌量影响通

4．辛伐他汀对细胞膜RhoA的含量的影响

5．辛伐他汀对细胞浆p-MYPT1表达量的影响

讨论

附图

参考文献

致谢

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