RhoA/ROCK信号转导通路抑制剂-C3转移酶和法舒地尔抑制大鼠肝星状细胞迁移

摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis)是机体对慢性肝损伤的创伤．愈合反应，是各种慢性肝病发展至肝硬化的中间环节和前期病变。因此，探讨肝纤维化的发病机制为其治疗提供可靠依据、早期逆转肝纤维化具有重要的临床价值。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纤维化的形成中起关键作用。在肝损伤及各种慢性肝病时，HSC 被激活，转换为肌成纤维细胞(myofibroblastic like cells)，表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)，合成各种细胞外基质成分，并且具有舒缩、黏附和定向迁移的能力。各种细胞因子和细胞信号转导途径在 HSC 活化过程中起着非常重要的作用。 RboA家族蛋白是细胞骨架肌动蛋白的重要调节分子，并作为信号分子参与众多与细胞骨架有关的细胞信号传导。RhoA 主要增加细胞的收缩力，促进粘着斑连接和应力纤维的装配。Rho 激酶(Rho-kinase，ROCK)是目前研究最清楚的RhoA 下游效应分子，作用于肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)使其失活，使胞浆内肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)磷酸化水平升高，肌动-肌球蛋白交联增加，从而促进肌动蛋白微丝骨架的聚合，引起细胞收缩、黏附和迁移。 Rho 蛋白与GTP结合后呈激活状态，与GDP结合呈失活状态。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)是第一个被发现能激活Rho的物质；C3转移酶(C3 transferase)引起的ADP核糖基化可使Rho蛋白失活；法舒地尔(fasudil)是 ROCK 抑制剂。近年来有研究证实Rho。家族蛋白在细胞迁移中发挥重要作用，Rho信号通路相关的细胞迁移与心血管、肿瘤和纤维化疾病有关。我们以前的研究工作发现整合素(integrin)-黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信号途径参与HSC的迁移过程，黏着斑相关非激酶(focal adhesion related non-kinase，FRNK)对HSC 迁移具有抑制作用。对整合素信号通路研究发现，基质不断提供信号给迁移细胞Rho蛋白影响细胞迁移。而RhoA/ROCK信号转导通路对HSC的行为影响尚不清楚。 本课题从活化的HSC细胞生物学基础研究出发，结合整体和离体试验，探讨RhoA/ROCK信号通路在肝纤维化形成中的作用以及对 HSC 形态、迁移和黏附的影响，为临床肝纤维化的治疗提供理论依据。实验共分三部分。 第一部分：大鼠肝纤维化组织Rboa、p-MLC和α-SMA 的动态表达 目的：观察RhoA/ROCK 信号转导通路关键信号分子RhoA、磷酸化的肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain，p-MLC(Thr18/Ser19))在实验性肝纤维化大鼠不同阶段肝组织中的表达规律，同时观察细胞骨架成分α-SMA在肝纤维化大鼠肝组织中的表达变化，探讨RhoA/ROCK 信号转导通路在肝纤维化发生中的作用。 方法：采用胆总管结扎(bile duct ligation，BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型；分别与手术后1 wk、2wk、3wk、4wk 麻醉动物，假手术组4wk麻醉动物，留取肝组织；HE及Masson三色染色观察肝纤维化大鼠的病理组织学变化；用免疫组织化学和 Western blot 检测RhoA、 p-MLC和α-SMA 的表达，用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测RhoA 的表达。 结果：①肝纤维化大鼠动物模型的建立：HE 及Masson三色染色显示：假手术组肝小叶结构完整，肝板排列整齐。模型组随着肝纤维化逐渐发展，出现肝脏广泛结缔组织增生，中央静脉周围出现胶原纤维沉积，肝小叶结构紊乱甚至形成假小叶。②免疫组织化学显示：假手术组大鼠肝脏RhoA呈阴性表达，造模 1 周汇管区间质细胞呈弱阳性表达，2～3周后，着色细胞逐渐增多，在汇管区、纤维间隔、肝窦周围及增生的胆管周围细胞出现棕黄色着色，第4周着色面积进一步扩大，少数细胞可见细胞质阳性染色；造模1wk、2 wk、3 wk、4 wk大鼠肝组织内RhoA阳性分布面积为5.32％±0.41％，13.43％±2.13％，22.14％±3.22％，31.48％±2.31％，均显著高于对照组(0.23％±0.14％)，P<0.05。免疫组织化学显示假手术组大鼠肝脏α-SMA在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达，随着纤维化进展，阳性着色细胞逐渐增多，汇管区、Disse 间隙、纤维间隔及增生的胆管周围细胞出现棕黄色着色。正常大鼠肝组织中p-MLC 仅在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达；随着肝纤维化的进展，血管壁表达增强，尤其以静脉血管壁明显，并在肝窦周围出现阳性表达细胞；造模1wk、2 wk、3 wk、4 wk大鼠肝组织内p—MLC阳性分布面积为13.47％±1.02％，20.05％±2.22％，28.31％±2.05％，35.41％±3.08％，与假手术组(2.01％±0.51％)比较，均有显著性差异，p<0.05。③假手术组、BDL 组在503bp处出现了RhoA基因的特异性条带，375 bp处出现了内参照β-actin 的条带。通过对电泳条带光密度扫描分析，假手术组大鼠肝脏有弱RhoA 基因表达(43.23％±5.03％)；与假手术组比较，BDL 组随着造模时间延长，RhoA 基因表达逐渐上调；造模1wk、2 wk、3 wk、4 wk基因表达分别为71.22％±1.06％，78.49％±2.24％，81.31％±3.21％，96.38％±2.12％，与假手术组比较均有统计学意义，p<0.05；造模4 wk RhoA mRNA 表达是假手术组的2.23倍。④Western blot在24kD的位置上出现了阳性杂交带，为RhoA的蛋白表达。从杂交信号的强度可知，假手术组大鼠肝组织中有微弱RhoA蛋白表达，随着造模时间延长，蛋白表达逐渐增加，1～4 wk分别增加了4.34倍、9.95倍、19.85倍、22.12倍。Western blot分析显示在1 8 kD 的位置上出现阳性杂交带为p-MLC 的蛋白表达，从杂交信号的强度可知，假手术组大鼠肝组织中有少量p-MLC 表达，随着肝纤维化加重表达逐渐增加，4 wk达高峰，是1 wk的5.00倍，假手术组的43.16倍。在43kD的位置上出现的阳性杂交带为α-SMA 蛋白表达，造模1～4 wk表达呈上升趋势，1～4 wk蛋白表达分别是假手术组的2.37倍，7.08倍，13.14倍和17.62倍，与对照组比较均有显著性差异，P<0.05。RhoA、p-MLC 分别与α-SMA 呈显著性正相关(r=0.98，P<0.01，r=0.976，P<0.01)。 结论：肝纤维化形成过程中RhoA、p-MLC和α-SMA 表达逐渐增加，提示RhoA/ROCK 信号转导通路和细胞骨架的变化在肝纤维化形成与发展中起一定作用。 第二部分：C3转移酶和法舒地尔对大鼠肝星状细胞黏附和迁移的影响 目的：观察RhoA 信号通路激动剂LPA、RhoA抑制剂-C3 转移酶和ROCK抑制剂-fasudil对 HSC 迁移和黏附的影响。 方法：本研究应用体外细胞培养技术，采用甲苯胺蓝法了解LPA 诱导HSC黏附的情况和C3转移酶及fasudil对HSC黏附的抑制作用；采用改良的Boyden双腔系统了解LPA对HSC迁移的诱导作用和C3转移酶及fasudil 对HSC迁移的抑制作用；应用激光共聚焦显微镜观察C3转移酶及fasudil 对HSC迁移的抑制作用；应用激光共聚焦显微镜观察C3转移酶及fasudil对HSC形态的影响。 结论：RhoA/ROCK信号转导通路抑制剂C3转移酶和fasudil对LPA诱导的HSC增殖、黏附和迁移具有抑制作用。 第三部分：RhoA/ROCK信号转导通路对大鼠HSC迁移影响的机制研究 目的：探讨RhoA/ROCK信号转导通路抑制剂对LPA诱导的HSC黏附、迁移抑制作用的分子机制。 方法：本研究应用体外细胞培养技术，采用Western blot和RT-PCR共扩增技术检测RhoA、p-MLC和α-SMA 的表达情况。用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检验细胞[C<,a><'2+>]。 结论：活化的HSC表达RhoA/ROCK信号通路关键信号分子RhoA和p-MLC。RhoA抑制剂-C3转移酶对HSC RhoA 蛋白表达有明显抑制作用，并且从基因水平抑制其合成，同时抑制了RhoA/ROCK下游信号分子p-MLC的表达，对细胞骨架成分α-SMA 的表达有抑制作用；ROCK抑制剂-fasudil对p-MLC和α-SMA 的表达均有抑制作用，并呈现浓度依赖关系。应用RhoA/ROCK 信号通路抑制剂干预HSC后，胞浆[C<,a><'2+>]<,i>没有发生变化，说明它是非C<,a><'2+>依赖的信号通路。

目录

论文说明：英文缩写

摘要

引言

第一部分大鼠肝纤维化组织RhoA、p-MLC和α-SMA的动态表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分C3转移酶和法舒地尔对大鼠肝星状细胞黏附和迁移的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分RhoA/ROCK信号转导通路对大鼠HSC迁移影响的机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一Rho信号转导通路和细胞迁移

综述二肝纤维化发病机制的研究进展

致谢

个人简历