X-连锁智力障碍致病基因CUL4B介导Jab1/CSN5泛素化降解及其分子机制初步探讨

摘要

CUL4B基因是本研究所于2007年采用定位候选克隆方法发现的一个X染色体连锁智力障碍(X-linkedintellectualdisability,XLID)致病基因，随后本研究所对该基因进行了一系列的分析与研究。CUL4B基因属于Cullin基因家族，CUL4BC末端结合ROC1(RING-boxprotein1，ROC1);N末端结合DDB1(DNAdamagebinding1，DDB1)，然后后共同组成Cullin-RINGE3泛素连接酶复合体(Cullin-RINGUbiquitinLigases，CRLs)，CUL4B在这个复合体中起支架蛋白的作用。
　　 本实验室利用差异蛋白组学分析发现，当CUL4B蛋白表达水平变化后一些蛋白随之变化，例如:PeroxiredoxinⅢ(PrxⅢ)、Triosephosphateisomerase1、AnnexinA5、Jab1/CSN5(Junactivatingbindingprotein,Jab1)等。PrxⅢ是CUL4BE3泛素连接酶的特异性底物蛋白，PrxⅢ可以清除细胞内的活性氧(ReactiveOxygenSpecies，ROS)。CUL4B突变会抑制PrxⅢ降解，导致PrxⅢ累积，从而使细胞内ROS水平异常降低，最终导致神经干细胞分化异常。CUL4BE3泛素连接酶复合体选择性降解WDR5，从而影响神经元细胞的特殊基因转录活性，从而使神经系统正常的生理功能出现异常。
　　 CUL4BE3泛素连接酶复合体的特异性底物可能对高等动物的神经系统的正常发育有重要作用。因而研究CUL4BE3泛素连接酶的特异性底物，不仅可以帮助我们更好地理解CUL4B基因的生物功能，更重要的是有助于揭示CUL4B突变导致XLID的致病机制。
　　 第一部分，CUL4BE3泛素连接酶介导Jab1/CSN5的泛素化降解
　　 在哺乳动物体内，CUL4有CUL4B和CUL4A两个高度同源的蛋白，CUL4E3泛素连接酶复合体的构成形式是ROC1-CUL4-DDB1的复合体形式。CUL4B在N末端特有的149个氨基酸残基可能使其在底物选择方面与CUL4A存在差异。为了研究CUL4B特异性底物以及其与CUL4B基因突变导致的XLID的关系，我们在HEK293(HumanEmbryonicKidney293cells，HEK293)、HeLa以及其它细胞中利用RNAi干扰技术降低CUL4B蛋白表达水平，进而对其可能的底物进行了筛选，发现Jab1/CSN5蛋白是CUL4BE3泛素连接酶复合体的底物。
　　 1)在HEK293细胞中，干扰CUL4B的表达后，发现Jab1/CSN5的蛋白水平有一定程度的升高，同时我们检测到Jab1/CSN5蛋白半衰期异常延长，说明CUL4B可以调节Jab1/CSN5蛋白的稳定性。
　　 2)在HEK293细胞中，蛋白酶体抑制剂也会引起Jab1/CSN5蛋白水平的异常升高，说明Jab1/CSN5是经由26s蛋白酶体进行降解。
　　 3)在HEK293细胞中，干扰ROC1或者DDB1的表达后，Jab1/CSN5蛋白水平有明显的升高且其半衰期明显延长;而当干扰CUL4A的表达后，并没有检测到Jab1/CSN5蛋白水平的升高以及其半衰期的变化。说明Jab1/CSN5的泛素化是由ROC1-CUL4B-DDB1复合体参与的。
　　 4)在HEK293细胞中，Jab1/CSN5存在于CUL4BE3泛素连接酶复合体中，但并没有与CUL4B蛋白直接作用。
　　 5)另外体内、外泛素化验证了Jab1/CSN5蛋白在CUL4BE3泛素连接酶存在的情况下发生多泛素化，提示CUL4BE3泛素连接酶通过影响Jab1/CSN5蛋白的多泛素化来调节蛋白的水平。
　　 综上所述，我们发现并证明了CUL4BE3泛素连接酶参与了Jab1/CSN5的多泛素化降解过程。
　　 第二部分，干扰CUL4B基因表达导致BMP信号通路异常活化
　　 有研究发现Jab1/CSN5可参与调节Smad7降解。Smad7蛋白是BMP(bonemorphogeneticprotein，BMP)信号通路的抑制性蛋白(InhibitorySmads，I-Smads)，Smad7蛋白的降解加速会使BMP通路异常活化。
　　 1)在HEK293细胞系中，干扰CUL4B表达后引起Jab1/CSN5的异常累积，而Smad7蛋白水平下降，并检测到磷酸化Smad1/5/8(pSmad1/5/8)蛋白水平上升;同时干扰CUL4B和Jab1/CSN5表达后发现Smad7和pSmad1/5/8蛋白水平基本恢复到对照组水平。这提示CUL4BE3泛素连接酶通过影响Jab1/CSN5，进而调节Smad7。
　　 2)在HEK293细胞系中，干扰CUL4B基因表达后会引起BMP通路下游的靶基因的异常活化;同时干扰CUL4B和Jab/CSN5基因表达后BMP通路下游靶基因的异常活化受到了抑制。这提示干扰CUL4B会引起BMP信号通路的异常激活。
　　 3)在Cul4b基因(Cul4b-/Y)条件性敲除小鼠的胚胎成纤维细胞(MouseEmbryoFibroblasts，MEFs)中，发现Jab1/CSN5蛋白水平的异常累积;并检测到Smad7蛋白水平的降低以及pSmad1/5/8蛋白水平的升高;以及BMP信号通路下游靶基因Id1、Msx-2的异常活化。
　　 以上结果表明，干扰CUL4B基因表达后会引起BMP通路的异常活化，而这种活化可以通过同时干扰Jab1/CSN5基因表达来进行拯救;在Cul4b条件敲除小鼠的MEFs中也检测到了BMP信号通路下游靶基因的活化。
　　 第一部分和第二部分的结果证实:Jab1/CSN5是CUL4BE3泛素连接酶复合体的特异性底物;同时发现干扰CUL4B基因表达后会引起BMP信号通路的异常活化。以上结果对CUL4B突变导致的XLID致病机制的研究提供了有价值的科学线索。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 CUL4B E3泛素连接酶介导Jab1的泛素化降解

材料与方法

结果

讨论

第二部分 干扰CUL4B引起Jab1／CSN5累积导致BMP信号通路异常活化

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

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