表达人INF-α真核表达载体抗HBV效应及机制研究

摘要

研究目的:
　　 目前全球约有四亿慢性乙型肝炎(CHB)患者，全世界每年约有一百万人死于乙肝导致的肝癌和肝硬化，其中超过三分之一的病例发生在我国。世界卫生组织也已将HBV划为自然存在的人类最重要的致癌因素之一。HBV的感染给我国人民的身体健康造成了严重危害，也给国家和社会带来了沉重的经济负担。
　　 在CHB的临床治疗实践中，因同时兼具直接抗病毒和免疫调节功能，干扰素-α(IFN-α)及其衍生物成为抗病毒治疗的一线用药，特别是对于年龄较小、病毒载量较低、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平较高的患者，以IFN-α为主的治疗具有非常明显的优势。但由于普通干扰素分子质量较小，血浆半衰期较短，需频繁地注射给药，患者的依从性较差;而聚乙二醇化的IFN-α(Peg-IFN-α)，虽然血浆半衰期有所提高，但其生物学活性明显降低，此外两者都具有较严重的不良反应，限制了其疗效的进一步发挥。因此，如何提高IFN-α的疗效对HBV的治疗起着至关重要的作用。
　　 随着分子生物学技术和分子药物学的不断充实和发展，以基因和细胞工程为基础的基因治疗，为人类攻克众多疾病带来了新的希望。基因治疗具有传统药物疗法所不具备的特殊优势，包括持续给药、靶向给药等。因此，我们提出采用含有人IFN-α基因的质粒为载体，以期增强IFN-α的局部表达，探索优化干扰素产生和应答的持续时间，从而取得更好的抑制HBV效果，为设计和利用基于IFN-α的新型抗HBV基因工程药物提供有益的启示。
　　 研究方法:
　　 首先，以含有HBV基因的人肝癌细胞系HepG2.2.15及其不含HBV的对照细胞HepG2为研究模型，采用脂质体将重组质粒pSecTagB-IFN-α转入肝癌细胞，通过半定量RT-PCR和ELISA检测转染后IFN-α的表达情况;然后，用实时定量PCR、ELISA，检测转染pSecTagB-IFN-α后对HepG2.2.15细胞中HBV复制、转录及抗原表达等的影响，以此作为评价内源性表达的IFN-α抗病毒生物学效应的指标;随后，采用半定量RT-PCR、实时定量PCR、westernblot对内源性表达的IFN-α抗HBV效应的机制进行探讨，检测转染后对JAK-STAT信号通路活化及抗病毒蛋白表达的影响;采用实时定量PCR和ELISA，比较内源性表达IFN-α与外加IFN-α对HBV的作用效果，以及比较内源性表达IFN-α和拉米夫定联用与外加IFN-α和拉米夫定联用后对HBV复制、转录及抗原表达等的影响;最后采用流式细胞术和半定量RT-PCR检测内源性表达的IFN-α对肝癌细胞表面MHCⅠ和Fas分子的影响。
　　 研究结果:
　　 (1)重组质粒(pSecTagB-IFN-α)可在肝癌细胞中有效表达。采用pSecTagB-IFN-α转染HepG2.2.15和HepG2细胞在其细胞上清中均可检测到较高水平IFN-α的分泌。
　　 (2)转染后IFN-α的表达抑制了HepG2.2.15细胞中HBV的复制。在肝癌细胞HepG2.2.15中内源性表达的IFN-α可产生以HBs、HBc的基因水平及HBVDNA载量、e抗原和表面抗原的下降为主要特征的抗HBV作用。
　　 (3)IFN-α的表达激活了JAK-STAT信号通路并诱导抗病毒蛋白的产生。转染pSecTagB-IFN-α后可使细胞中的JAK-STAT信号通路激活，促进了肝癌细胞中抗病毒蛋白ISG15、OAS-1、IFIT-1和IFIT-3的表达。
　　 (4)转染pSecTagB-IFN-α后肝细胞中双链RNA受体上调。内源性表达的IFN-α，使RIG-I、MDA-5、LGP-2、PKR和TLR3在肝癌细胞中的表达都有不同程度的上调。
　　 (5)内源性表达的IFN-α比外源IFN-α有更强的抗HBV作用。在HepG2.2.15细胞中，转染IFN-α表达载体与同等剂量的IFN-α胞外刺激相比，转染pSecTagB-IFN-α有更为明显的抗HBV作用，包括HBx、HBs、HBc的基因水平及HBVDNA载量、e抗原和表面抗原的降低。
　　 (6)内源性表达的IFN-α与拉米夫定联合使用具有更明显的抗HBV效果。转染pSecTagB-IFN-α与拉米夫定联合使用可产生比外加IFN-α与拉米夫定联用组更为明显的HBx、HBs、HBc的基因水平及HBVDNA载量、e抗原和表面抗原的下降。
　　 (7)转染pSecTagB-IFN-α可增强MHCI和Fas的表达。内源性表达的IFN-α可在一定程度上上调肝癌细胞表面MHCⅠ和Fas的表达水平。
　　 结论及意义:
　　 本实验采用含有人IFN-α基因的重组质粒(pSecTagB-IFN-α)转染肝癌细胞，可在细胞上清中分泌较高水平的IFN-α并发挥对HBV的抑制功能。通过机制研究发现，转染IFN-α表达载体后促进了一系列抗病毒蛋白和双链RNA受体的表达，与等剂量的外源性IFN-α刺激相比，内源性表达IFN-α具有更为显著的抗HBV作用，与拉米夫定联合应用后也显示出比对外加IFN-α和拉米夫定连用组更明显的HBV抑制作用。该研究为以IFN-α为基础的新型抗HBV药物的研究提供有益的启示，同时可为基因治疗与传统药物疗法的结合提供新的途径。

目录

声明

摘要

主要符号说明

第一部分：文献综述 HBV的生物学特征及治疗学概述

1 HBV的病原学特征

1．1 HBV的形态结构

1．2 HBV的病毒基因组

1．3 HBV的复制周期

2 HBV的感染与流行病学概述

2．1 HBV的流行概况

2．2 HBV感染的免疫应答机制

2．3 HBV感染的免疫致病机制

3 乙型病毒性肝炎临床诊断治疗现状

3．1 乙型病毒性肝炎的血清学免疫标志物检测及临床意义

3．2 乙型病毒性肝炎的临床分型及并发症

3．3 乙型病毒性肝炎的药物学治疗方法

4 IFN-α与HBV

4．1 干扰素概述

4．2 IFN-α抗HBV的机制

4．3 IFN-α临床应用的主要类型

4．4 IFN-α治疗HBV存在的问题

4．5 HBV的基因治疗策略

参考文献

第二部分：表达人IFN-α真核表达载体抗HBV效应及机制研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 主要实验材料及试剂

2．2 主要试剂配制

2．3 主要仪器设备

2．4 主要实验方法

3 实验结果

3．1 重组质粒pSecTagB-IFN-α在肝细胞中的表达

3．2 pSecTagB-IFN-α抑制了HepG2．2．15细胞中HBV的复制

3．3 pSecTagB-IFN-α激活了JAK-STAT信号通路并诱导抗病毒蛋白的产生

3．4 pSecTagB-IFN-α转染上调双链RNA受体的表达

3．5 内源性表达的IFN-α比外源性表达的IFN-α有更强的抗HBV作用

3．6 pSecTagB-IFN-α与拉米夫定的联合可更有效地抑制HBV

3．7 转染pSecTagB-IFN-α可以上调MHC Ⅰ和Fas的表达

4 讨论和总结

参考文献

文章创新点及意义

致谢

待发表论文

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