黑根霉胞外多糖的分离纯化及其抗肿瘤活性研究

摘要

恶性肿瘤是导致人类死亡的一个主要原因，全球每年约有760万人死于癌症，并且死亡人数逐年增加。目前，癌症的治疗主要以手术、化疗和放疗为主。大多数疗药物在杀灭肿瘤细胞的同时，也损害了大量正常细胞，有很强的毒副作用。因此，寻找更为有效的、副作用小的肿瘤治疗药物日趋重要。近年来，许多对机体毒性反应低、并能增加化疗药物敏感性，具有新型化学结构的抗肿瘤的有效成分和活性物质已经从天然产物中筛选和分离出来。真菌多糖广泛存在于真菌的子实体、菌丝体以及发酵培养液中，并被证明具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖等多种生物活性，尤其在抗肿瘤方面，真菌多糖可通过损伤肿瘤细胞的膜结构，诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞生长。
　　 黑根霉(Rhizopus nigricans)是一种接合菌类丝状真菌，由于黑根霉具有生物转化的功能，并且能够产生有机酸而被广泛用于化工与制药行业。本论文从黑根霉发酵液中提取并分离得到胞外粗糖EPS，经过离子交换层析以及凝胶过滤层析纯化得到两种胞外多糖，分别命名为EPS1-1、EPS-2，并对两种多糖的纯度及一级结构进行初步解析;研究胞外多糖对肿瘤细胞的抑制作用，并初步探讨其抑制肿瘤的作用机制。
　　 1.黑根霉胞外多糖的分离纯化及结构解析
　　 发酵液去菌丝后经浓缩，醇沉、除蛋白、脱色后得到粗多糖EPS。粗多糖经DEAE-Fast Flow阴离子交换层析后获得两个组分EPS-1、EPS-2，进一步经过Sephadex G-100以及SephadexG-75凝胶层析纯化后，获得两个纯化组分命名为EPS1-1、EPS-2。苯酚硫酸法确定EPS1-1、EPS-2含糖量分别为96.8％和82.7％;理化性质分析EPS1-1不含淀粉、蛋白质和糖醛酸，EPS-2不含淀粉、蛋白质但含有少量糖醛酸。
　　 高效凝胶渗透色谱确定EPS1-1、EPS-2组分均一，分子量分别为9682 Da和1.979×105 Da。单糖组成分析表明EPS1-1主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及果糖组成，摩尔比例为:5.89∶3.64∶3.2∶1;EPS-2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖组成，摩尔比例为:17.8∶2.3∶1。红外光谱及核磁共振分析分析两种多糖具有多糖的特征吸收峰，均为β型糖苷为主的吡喃型糖。甲基化分析表明EPS1-1主要以→6)Glcp(1→方式连接。
　　 2.黑根霉胞外多糖抗肿瘤活性研究
　　 MTT法检测两种多糖对K562、HCT-116、Hela细胞的抑制率，结果显示EPS1-1对K562和HCT-116细胞均有明显抑制作用，且抑制效果呈现剂量依赖性;800μg/mL的EPS1-1对HCT-116细胞抑制率最大，达36.1％，对Hela细胞无明显抑制作用。EPS-2抑制HCT-116细胞增殖作用明显，最高抑制率为40.5％，对其他两种细胞无明显抑制作用。
　　 采用Hoechst33258染色方法观察不同浓度EPS1-1处理肿瘤细胞后细胞形态学的变化，结果发现对照组细胞形态一致，染色均匀，呈现出微弱的蓝色荧光，处理组细胞核呈现致密的颗粒状蓝色荧光;PI染色以及Annexin V-FITC/PI染色结果表明EPS1-1处理HCT-116细胞24h时，S期细胞由13.4％增加到22.5％;在100-4001μg/ml的浓度范围内，随着EPS1-1浓度升高，发生早期凋亡的HCT-116逐渐增多，当400μg/ml浓度处理时，达到了20.8％;表明了EPS1-1诱导HCT-116细胞周期停滞在S期并发生了早期凋亡。
　　 分别通过JC-1染色和DCFH-DA荧光探针研究线粒体膜电位和细胞内活性氧的产生，结果发现EPS1-1处理组诱导线粒体膜电位下降（绿色荧光增强），400μg/mL EPS1-1处理组ROS产生量比对照组高2.75倍。RT-PCR方法检测EPS1-1对HCT-116细胞p53，Bcl-2，Bax基因表达量的影响，结果发现，Bcl-2的mRNA表达量随着处理浓度的升高不断降低，而p53和Bax的mRNA表达量升高;综上所述，EPS1-1通过线粒体内源性途径诱导结肠癌细胞HCT-116发生凋亡。
　　 本文首次从黑根霉发酵液中分离纯化出两种组分均一胞外多糖EPS1-1和对结肠癌细胞HCT-116均有很强的抑制作用;抗肿瘤机制研究表明EPS1-1通过线粒体途径诱导HCT-116细胞发生凋亡。

目录

声明

摘要

本文缩略词

第一章 绪论

1．真菌多糖的研究进展

2．多糖杭肿瘤机制研究进展

3．本论文的研究目的及其意义

第二章 黑根霉胞外多糖的分离纯化与结构解析

1．实验材料与仪器

1．1 材料与试剂

1．2 实验仪器

2．实验方法

2．1 黑根霉的培养

2．2 黑根霉胞外多糖的提取

2．3 粗多糖总糖含量测定

2．4 黑根霉胞外多糖的分离纯化

2．5 EPS1-1、EPS-2理化性质分析

2．6 两种纯化组分纯度以及分子量测定

2．7 两种多糖单糖组成分析

2．8 红外光谱分析

2．9 核磁共振波谱分析

2．10 EPS1-1的甲基化分析

3．实验结果

3．1 黑根霉胞外多糖的提取

3．2 黑根霉胞外粗糖的糖含量测定

3．3 DEAE Sepharose Fast Flow初步分离

3．4 葡聚糖凝胶进一步纯化

3．5 EPS1-1、EPS-2理化性质分析

3．6 EPS1-1、EPS-2的纯度及分子量测定

3．7 EPS1-1、EPS-2单糖组成分析

3．8 红外光谱分析

3．9 核磁共振波谱分析结果

3．10 EPS1-1的甲基化分析

4．讨论与小结

第三章 黑根霉胞外多糖抗肿瘤活性研究

1．实验材料与仪器

1．1 材料与试剂

1．2 实验仪器

2．实验方法

2．1 肿瘤细胞的培养

2．2 体外抗肿瘤增殖活性筛选

2．3 EPS1-1抑制肿瘤细胞HCT-116增殖的机制研究

2．4 数据统计处理

3．实验结果

3．1 两种纯化多糖体外抗肿瘤活性筛选

3．2 EPS1-1抑制HCT-116细胞增殖的作用机制研究

4 讨论与小结

结论与展望

参考文献

致谢

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