小肠结肠炎耶尔森菌生物学特性和分子分型研究

摘要

[研究背景]
　　 小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）是一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，属于耶尔森菌属，是该菌属的三大致病菌之一。小肠结肠炎耶尔森菌广泛存在于自然环境中，主要通过污染食物进入人体。人感染小肠结肠炎耶尔森菌后，主要表现为胃肠道症状，如呕吐、腹痛、腹泻等，多具有自限性。但是，部分患者可出现一系列严重的并发症，如心内膜炎、反应性关节炎、组织脓肿等，甚至引起败血症导致死亡。在欧洲，由该菌和假结核耶尔森菌引起的耶氏菌病在常见的人畜共患病中占第四位;在美国，由该菌引起的疾病每年发病约11.7万例;在我国，文献可查的小肠结肠炎耶尔森菌暴发有两次。该菌可分为6个生物型(1A，1B和2～5)和60个血清型，主要通过检测ail、ystA、ystB、yadA和virF5个毒力基因来判断其致病性。小肠结肠炎耶尔森菌对青霉素和一代头孢天然耐药，对其他种类的抗菌药物具有不同程度的耐药率。脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field GelElectrophoresis，PFGE)分型是现阶段小肠结肠炎耶尔森菌分子分型最常用的方法，主要用于菌株的溯源。
　　 山东省自2006年开始，设立高密市和五莲县两个监测点对小肠结肠炎耶尔森菌开展监测，至2011年共从鸡、牛、羊、猪等动物粪便和生熟肉、苍蝇中分离到小肠结肠炎耶尔森菌237株。这些菌株的动力、生物型、血清型、毒力基因和抗菌药物敏感性等生物学特性尚缺乏系统性的研究分析，分子分型也尚未开展。
　　 [研究目的]
　　 1、系统分析分离到的小肠结肠炎耶尔森菌的动力、生物型、血清型、毒力基因和抗菌药物敏感性等生物学特性及其时间、地区和宿主分布特点。
　　 2、对分离到的小肠结肠炎耶尔森菌进行PFGE分型，了解菌株的亲缘关系，探讨表型分型和PFGE分型的相互关系。
　　 3、初步建立山东省小肠结肠炎耶尔森菌的基础数据库，为该菌的长期监测奠定基础，为耶氏菌病的预测、预警提供技术支持。
　　 [研究方法]
　　 1、动力试验采用半固体穿刺法，生物分型根据生化反应进行判断，血清分型采用玻片凝集法，毒力基因检测采用PCR法，抗菌药物敏感性检测采用VITEK2 COMPACT系统和AST-GN16药敏卡。
　　 2、PFGE分型参照PulseNet China推荐的标准方法进行，电泳图谱处理及聚类分析采用BioNumerics6.1软件。
　　 3、资料的录入、整理和简单分析采用Excel2007软件，数据的统计学分析采用SPSS16.0软件。
　　 [研究结果]
　　 1、动力为“中”的菌株占4.2％(10/237)，动力为“差”的菌株占3.0％(7/237)，其余菌株动力良好。动力为“中”或“差”的菌株在各年份、各地区和多种宿主中均有分布。
　　 2、98.7％(234/237)的菌株为生物1A型;其余3株菌为生物4型，均从2006年高密市的猪粪样本中分离到。
　　 3、49.8％(118/237)的菌株凝出相应血清型，以O∶5(21.9％，52/237)和O∶8(21.1％，50/237)型为主。2011年可分血清型最多（5种）;高密分离株O∶5型最多(23.9％，39/163)，五莲分离株O∶8型最多(33.8％，25/74);各宿主分离株均以O∶5和O∶8型为主。
　　 4、ystB基因的阳性率最高，为81.4％(193/237); ail和ystA基因仅在3株菌中检测到，阳性率为1.3％(3/237);未检测到yadA和virF基因。ystB基因阳性菌株在不同时间、地区和宿主中均为优势菌株。
　　 5、共有235株菌获得抗菌药物敏感性试验的结果。菌株对头孢曲松、头孢吡肟、阿米卡星、庆大霉素和替加环素的敏感率最高，为100％;对氨苄西林的耐药率最高，为94.5％(222/235)。菌株的多重耐药率为12.3％(29/235)。2007和2011年分离株对呋喃妥因的敏感情况有差异(P＜0.05);高密市分离株对复方新诺明的耐药率(10.4％，17/163)高于五莲县分离株(1.4％，1/72)(P＜0.05);毒力基因A型（ail-ystAystB+yadA-virF-）菌株对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢唑林、头孢西丁的耐药率和对呋喃妥因的中介耐药率(依次为99.0％，190/192;89.6％,172/192;94.8％,182/192;80.2％,154/192;94.8％,182/192)高于毒力基因B型（ail-ystA-ystB-yadA-virF）菌株(依次为72.5％，29/40;65.0％，26/40;67.5％,27/40;42.5％,17/40;65.0％,26/40)(P＜0.05)。
　　 6、237株菌中的231株被分为144个PFGE型别，相似性系数在61.1％～100.0％，无明显优势型别。五莲分离株的PFGE聚集性高于高密分离株，含7株及以上菌株的PFGE型别均出现在五莲县。其余6株菌未获得PFGE条带。144个PFGE型别中有15个型别在中国疾控中心数据库中可找到相同或相近的型别。
　　 7、17株动力为“中”或“差”的菌株中的14株形成3个聚类簇;52株O∶5血清型菌株中的31株形成4个聚类簇，50株O∶8血清型菌株中的19株形成1个聚类簇;41株毒力基因B型（ail-ystA-ystB--yadA-vir-）菌株中的20株形成1个聚类簇;药敏型别在PFGE聚类中分布分散，无特异性。
　　 8、动力、生物分型、血清分型、毒力基因分型、药敏分型和PFGE分型的Simpson指数分别为0.1362、0.0251、0.6564、0.3081、0.7214和0.9982。
　　 [结论]
　　 1、高密市和五莲县的小肠结肠炎耶尔森菌存在动力突变株;菌株几乎全为生物1A型;血清型以O∶5和O∶8型为主，存在地区差异;菌株携带的毒力基因主要为ystB基因，无传统致病性菌株;耐药谱广泛，大部分菌株对青霉素类和一、二代头孢耐药，存在一定的多重耐药现象，ystB基因阳性的生物1A型菌株与ystB基因阴性的生物1A型菌株耐药性不同。
　　 2、高密市和五莲县的小肠结肠炎耶尔森菌存在多克隆系，基因多态性明显，部分克隆株长期存在，五莲地区可能存在相对优势克隆系;部分山东分离株可能与其他省份菌株存在联系。
　　 3、小肠结肠炎耶尔森菌的PFGE分型可能与其动力有一定相关，与生物型、血清型、毒力基因型和药敏型别不具有相关性。
　　 4、PFGE具有强大的分型能力，但在菌株溯源时需与表型分型联合使用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 概述

1．1 病原学

1．2 流行病学

1．3 毒力基因

1．4 抗菌药物敏感性

1．5 分子分型

2 研究的目的和意义

3 技术路线图

材料与方法

1 实验材料

1．1 研究对象

1．2 实验试剂

1．3 主要仪器

1．4 所用软件

2 方法

2．1 动力试验

2．2 生物分型

2．3 血清分型

2．4 毒力基因检测

2．5 抗菌药物敏感性检测

2．6 PFGE分型

2．7 数据处理与分析

3 质量控制

3．1 设计阶段

3．2 实验实施阶段

3．3 资料分析阶段

结果

1 动力试验

2 生物分型

3 血清分型

3．1 不同年份菌株的血清型分布

3．2 不同地区菌株的血清型分布

3．3 不同宿主菌株的血清型分布

4 毒力基因检测

4．1 不同年份菌株的毒力基因型别分布

4．2 不同地区菌株的毒力基因型别分布

4．3 不同宿主菌株的毒力基因型别分布

5 抗菌药物敏感性检测

5．1 总体情况

5．2 不同年份菌株的抗菌药物敏感情况

5．3 不同地区菌株的抗菌药物敏感情况

5．4 不同宿主菌株的抗菌药物敏感情况

5．5 不同生物学特性菌株的抗菌药物敏感情况

6 PFGE分型

6．1 总体情况

6．2 不同年份菌株的PFGE分型情况

6．3 不同地区菌株的PFGE分型情况

6．4 不同宿主菌株的PFGE分型情况

6．5 菌株溯源

7 表型分型与PFGE分型间的关联

8 不同分型方法的分辨能力

讨论

1 动力试验

2 生物分型

3 血清分型

4 毒力基因检测

5 抗菌药物敏感性

6 PFGE分型

7 表型分型与PFGE分型间的关联

8 不同分型方法的分辨能力

结论

创新与不足

1 创新

2 不足

附录

附录一 实验中溶液的配置方法

附录二 附表附图

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文