D609及其诱导成的神经元样细胞对APP/PS1双转基因小鼠的作用及其相关机制研究

摘要

研究背景与研究目的：
　　阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种年龄相关的中枢神经系统变性疾病，是老年痴呆的最常见的原因。可溶性β淀粉酶(Aβ)的增多和Aβ过度沉积是AD的主要致病因素。现在对阿尔茨海默病还没有根治的治疗方法。
　　很多研究表明氧化应激损伤是AD的重要发病机制，可以使Aβ的产生增多。在AD的发病早期就会出现氧化应激损伤，抗氧化治疗已经成为治疗AD的靶点。有证据表明很多自由基清除剂具有神经保护作用，能够减轻AD的风险，减缓AD的病变进程。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是脑内的自由基清除剂，脑内的GSH稳态失衡是AD的重要发病机制，因此能够“模仿”GSH功能的化合物可能能够减轻AD的氧化应激损伤。
　　小胶质细胞是脑内的单核吞噬细胞，在AD病人和AD动物模型中主要聚集在老年斑的周围。脑内小胶质细胞的功能取决于它的活化状态，M2型的小胶质细胞可以通过吞噬Aβ和分泌神经营养因子在AD中发挥神经保护作用，因此通过调节小胶质细胞的活化状态和神经炎症能够减轻AD动物模型中的Aβ的沉积。干细胞移植能通过调节小胶质细胞的活化状态来发挥神经保护作用。
　　小分子化合物三环葵烷-9-基一二硫代碳酸酯钾盐（tricyclodecan-9-yl-xanthogenate，D609）是磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C特异性抑制剂，是一种有效的抗氧化剂。D609是一种GSH类似物，能够清除自由基。那么D609对AD动物模型是否有保护作用呢？是否能够通过抗氧化应激来发挥保护作用呢？D609能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells, MSCs)分化成神经原样细胞，移植这种神经元样细胞可以有效的治疗脊髓损伤。那移植神经元样细胞是否可以治疗AD?是否能够调节小胶质细胞的活化状态呢？
　　依据上述背景，本研究以APP/PS1双转基因小鼠为模型，研究长期腹腔注射D609对AD的保护作用及其作用机制;利用D609诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells HUMSCs)分化成神经元样细胞(neuron-like cells，HUMSC-NCs)，向APP/PS1双转基因小鼠脑内立体定向移植HUMSC-NCs，研究其对APP/PS1小鼠的作用及其机制。
　　研究方法：
　　1.为明确D609对AD动物模型的作用及其作用机制，用4.5月龄的APP/PS1双转基因小鼠为模型，分为对照组和D609治疗组。D609治疗组给予D609(10 mg/kg(.)d)腹腔注射连续10周，对照组给予同等体积PBS腹腔注射10周。采用morris水迷宫检测小鼠的行为学:寻找隐藏平台实验检测小鼠的学习能力，空间探索实验检测小鼠的记忆能力。用硫磺素硫染色的方法，检测小鼠脑冰冻切片老年斑沉积的面积，用Elisa定量来检测脑内可溶性的Aβ40及Aβ42含量。采用GSH，GSSG，SOD，GPX，MDA和蛋白质羟基检测试剂盒检测氧化应激损伤。荧光定量PCR检测TNF-α，IL-6和IL-1β的含量。Western检测BACE1，AβPP，CTFβ的含量。
　　2.为明确D609对脐带间充质干细胞的诱导作用，取足月剖宫产胎儿的脐带组织，分离得到脐带间充质干细胞后传代扩增。用D609诱导脐带间充质干细胞，使其分化成神经元样细胞。用倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化，用免疫荧光检测神经元特异性标记物NSE，MAP2及胶质细胞的标志物GFAP的表达。
　　3.为明确HUMSC-NCs对AD动物模型的作用及其机制，用6月龄的APP/PS1双转基因小鼠为模型，分为对照组，HUMSCs组和HUMSC-NCs组。HUMSC-NCs组给予5×104/2μl个HUMSC-NCs细胞立体定向注射，HUMSCs组给予5×104/2μl个HUMSC细胞立体定向注射，对照组给予2μ l PBS立体定向注射。3周后行morris水迷宫检测小鼠的行为学:寻找隐藏平台实验检测小鼠的学习能力，空间探索实验检测小鼠的记忆能力。用硫磺素硫染色的方法，检测小鼠脑冰冻切片老年斑沉积的数量及面积，Elisa定量来检测脑内可溶性的Aβ40及Aβ42含量。采用免疫印记Western blot检测synapsin(I)、NEP和IDE的水平。采用免疫荧光检测小胶质细胞标志物Iba1的含量。用RT-PCR检测M2型小胶质细胞的标志物YM-1，Arg-1，MRC1，FIZZ1，CD163，IL-4的含量，M1型小胶质细胞相关炎症因子IL-1β，TNF-α和IL-6的含量。
　　研究结果：
　　1.D609对APP/PS1双转基因小鼠的保护作用及其作用机制
　　1.1 D609改善了APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力缺陷。水迷宫实验发现，与对照组相比，D609组小鼠潜伏期明显缩短，在探索实验中，D609组小鼠穿越平台的次数及在平台所在象限的时间均有明显增加。两组之间游泳速度没有统计学意义。这说明腹腔注射D609能够提高APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力。
　　1.2 D609明显减少了APP/PS1小鼠脑内老年斑的沉积和可溶性Aβ的水平。水迷宫实验结束后，用硫磺素硫染色的方法检测小鼠脑内的老年斑的水平，结果发现，与对照组相比，D609组APP/PS1小鼠大脑海马和皮层的老年斑的沉积明显降低。利用ELISA试剂盒检测全脑可溶性Aβ含量发现，D609能明显减少可溶性Aβ40和Aβ42的含量。以上结果表明D609明显减少了APP/PS1小鼠脑内Aβ水平。
　　1.3 D609对APP/PS1双转基因小鼠的保护作用机制研究
　　1.3.1 D609减轻了APP/PS1小鼠脑内的氧化应激损伤。D609明显增加了APP/PS1小鼠脑内GSH的含量及GSH/GSSG的比值。D609没有增加GPx的含量，但明显增加了APP/PS1小鼠脑内SOD抗氧化酶的含量。与对照组相比，D609组APP/PS1小鼠蛋白（蛋白质羟基）和脂质(MDA)损伤明显降低。以上研究表明，D609能减少小鼠脑内的氧化应激损伤。
　　1.3.2 D609减轻了APP/PS1小鼠脑内的炎症。RT-PCR结果表明，与对照组相比，D609组小鼠脑内IL-1β和TNF-α的含量明显降低，IL-6的水平没有统计学意义。
　　1.3.3 D609通过降低BACE1的水平减少了CTFβ的含量。我们用westernblot检测了小鼠脑内BACE1，APP和CTFβ的含量。与对照组相比，D609明显减轻了小鼠脑内BACE1和CTFβ的含量，APP的含量没有改变。这些结果表明，D609降低了BACE1的含量及BACE1剪切APP生成的C-末端产物CTFβ的含量，从而降低了脑内Aβ的水平。
　　2.HUMSC-NCs对APP/PS1双转基因小鼠的保护作用及其作用机制
　　2.1 D609诱导人脐带间充质干细胞(HUMSCs)分化成神经元样细胞(HUMSC-NCs)。从人脐带中分离获得HUMSCs，流式结果表明，HUMSCs表达CD73，CD90和CD105，不表达CD34，CD45和HLA-DR。60μ g/mlD609诱导HUMSCs分化成神经元样细胞，免疫荧光染色表明HUMSC-NCs表达NSE和MAP2，不表达GFAP。
　　2.2 HUMSC-NCs改善了APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力缺陷。水迷宫实验发现，HUMSCs组与对照组相比没有统计学意义，与对照组相比，HUMSC-NCs组小鼠潜伏期明显缩短。在探索实验中，与对照组相比，HUMSC-NCs组小鼠穿越平台的次数及在平台所在象限的时间均有明显增加。三组之间游泳速度没有统计学意义。这说明HUMSC-NCs治疗可以明显改善APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力缺陷，而HUMSC组不能改善APP/PS1双转基因小鼠的学习和记忆能力缺陷。
　　2.3 HUMSC-NCs明显增加了APP/PS1小鼠脑内突触蛋白1的含量。()Western blot结果表明，与对照组相比，HUMSC-NCs组小鼠脑内突触蛋白1的含量明显增加。这说明，HUMSC-NCs组小鼠学习记忆能力的改善可能与突触蛋白1含量的增加有关。
　　2.4 HUMSC-NCs明显减少了APP/PS1小鼠脑内老年斑的沉积和可溶性Aβ的水平。水迷宫实验结束后，用硫磺素硫染色的方法检测小鼠脑内的老年斑的水平，结果发现，与对照组相比，HUMSC-NCs组APP/PS1小鼠大脑海马和皮层的老年斑的沉积明显降低，HUMSCs组没有改变。利用ELISA试剂盒检测全脑可溶性Aβ含量发现，HUMSC-NCs组能明显减少可溶性Aβ40和Aβ42的含量，HUMSCs组没有改变。以上结果表明HUMSC-NCs明显减少了APP/PS1小鼠脑内Aβ水平。
　　2.5 HUMSC-NCs对APP/PS1双转基因小鼠的保护作用机制研究
　　2.5.1 HUMSC-NCs增加了APP/PS1双转基因小鼠脑内小胶质细胞的激活。采用免疫荧光检测小胶质细胞标志物Iba1的含量，结果表明，与对照组相比，在HUMSC-NCs组中，激活的小胶质细胞明显增加。
　　2.5.2 HUMSC-NCs导致M2型小胶质细胞的激活、调节了免疫炎症。RT-PCR结果表明，与对照组相比，HUMSC-NCs组小鼠脑内M2型小胶质细胞的标志物:Arg-1，YM-1，MRC1，FIZZ1和CD163含量明显增加。用免疫荧光双标标记AMCase与小胶质细胞，在HUMSC-NCs组小鼠脑内可以发现表达AMCase的小胶质细胞。这表明HUMSC-NCs激活的小胶质细胞为M2型的小胶质细胞。我们采用RT-PCR检测炎症因子，与对照组相比，HUMSC-NCs明显减少了APP/PS1小鼠脑内促炎因子TNF-α和IL-1β的含量，但没有改变IL-6的含量。HUMSC-NCs增加了小鼠脑内抑炎因子IL-4的含量。免疫荧光双标结果表明，与对照组相比，HUMSC-NCs组小鼠脑中表达IL-4的小胶质细胞明显增加，表达TNF-α的小胶质细胞明显减少。这些结果表明，M2型小胶质细胞的激活与调节炎症有关。
　　2.5.3 HUMSC-NCs增加了APP/PS1双转基因小鼠脑内降解酶的含量。我们用RT-PCR检测小鼠海马和皮质内降解酶的含量，与对照组相比，HUMSC-NCs组小鼠皮质和海马内NEP和IDE的含量明显增加。Western blot结果表明，与对照组相比， HUMSC-NCs组小鼠皮质和海马中IDE的含量明显增加，HUMSC-NCs组小鼠海马中NEP的含量明显增加，皮质的含量没有差异。
　　结论
　　1.D609改善了APP/PS1双转基因小鼠的认知功能，减轻了老年斑的沉积。
　　2.D609的作用机制与减轻氧化应激、减少炎症反应及降低BACE1的水平有关。
　　3.D609诱导HUMSCs分化成HUMSC-NCs。
　　4.HUMSC-NCs改善了APP/PS1双转基因小鼠的认知功能，增加了突触蛋白1的含量，减轻了老年斑的沉积。
　　5.HUMSC-NCs的作用机制与免疫炎症调节有关。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分 D609对APP／PS1双转基因小鼠的保护作用及其作用机制

一、目的

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

附图

第二部分 HUMSC-NCs对APP／PS1双转基因小鼠的保护作用及其作用机制

一、目的

二、材料与方法

三、实验结果

四、讨论

附图

结论

参考文献

致谢

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