E-cadherin相关卵巢癌细胞立体悬浮生长模型的构建及其特征

摘要

研究背景:
　　卵巢癌是妇科常见肿瘤，也是女性恶性肿瘤主要的死亡原因。由于早期卵巢癌无明显临床表现，大多数患者在诊断时已经处于晚期腹腔转移阶段。晚期卵巢癌患者腹腔中大量难治性腹水的出现，不仅加剧了患者的痛苦，也为卵巢癌细胞产生耐药和发生转移提供了必备的存活环境，由此决定了卵巢癌的不良预后。多细胞球体(MulticellularSpheroids，MCS)是卵巢癌细胞在腹水中的一种主要存在方式，越来越多的研究认为MCS的形成是卵巢癌细胞脱落后在腹水中存活的必要形式，是卵巢癌细胞成功发生转移的必要条件。所以，构建卵巢癌细胞的悬浮MCS模型对于研究晚期卵巢癌腹水中的肿瘤细胞特性，尤其是其对化疗药物的耐受性，具有重要的临床意义。
　　作为肿瘤细胞非锚定依赖性生长的一种重要方式，悬浮MCS的生存和功能很大程度上依赖于细胞间粘附分子的作用。E-cadherin作为一种细胞间粘附分子，一度被认为是肿瘤抑制蛋白。近年研究发现，E-cadherin的作用并非如此简单。在乳腺癌中，E-cadherin表达下降或缺失预示着肿瘤细胞的恶性程度较高、预后较差，但E-cadherin表达也是乳腺癌细胞悬浮MCS中细胞粘附和聚集的必要条件。但需要注意的是，E-cadherin在卵巢癌中的作用与其他肿瘤存在很大差别。E-cadherin在卵巢癌细胞中的表达显著高于正常卵巢上皮细胞，并能通过介导细胞粘附激活卵巢癌细胞内的PI3K/AKT及MEK/ERK等信号通路促进卵巢癌细胞的生长和增殖，这高度提示E-cadherin在卵巢癌细胞悬浮MCS中可能发挥独特而重要的作用。但是，E-cadherin在卵巢癌细胞中的作用及机制仍存在很大争议。
　　目的:
　　卵巢癌是妇科恶性肿瘤的主要死因，而晚期卵巢癌患者腹水中存在的多细胞球体(MulticellularSpheroids，MCS)是转移卵巢癌细胞的主要存在方式。E-cadherin作为一种重要的细胞粘附分子，我们推测在MCS的形成和存活中发挥重要作用。因此我们建立高表达E-cadherin卵巢癌细胞的立体悬浮培养模型，并对其生长增殖行为和对化疗药物的耐药性进行初步研究。
　　方法:
　　1.通过多聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂(2-hydroxylethylmethacrylate，Poly-HEMA)凝胶阻止细胞贴壁，对E-cadherin表达水平各异的三株卵巢癌细胞进行立体悬浮培养，观察、比较其悬浮生长的过程、特点及差别;
　　2.通过钙离子剥夺实验证明E-cadherin在卵巢癌悬浮MCS中的作用;
　　3.通过CCK8细胞增殖实验检测MCS生长增殖特点;
　　4.通过CCK8细胞增殖实验检测MCS对化疗药物顺铂的敏感性。
　　结果:
　　1.成功构建了高表达E-cadherin的SKOV-3卵巢癌细胞立体悬浮生长MCS模型。与低表达E-cadherin的OVCAR-3和不表达E-cadherin的SKOV-3形成的悬浮细胞团相比，高表达E-cadherin的卵巢癌细胞形成的MCS体积大、细胞连接紧密度高、维持时间长。
　　2.MCS在钙离子螯合剂EDTA的作用下逐渐分解，最后变为单个细胞或仅含几个细胞的微小细胞团块;对照组的悬浮MCS用胰酶消化，MCS裂解程度远差于EDTA作用的效果，仍呈大细胞团状。
　　3.高表达E-cadherin的SKOV-3卵巢癌细胞悬浮MCS(MCSofSKOV-3withhighexpressionofE-cadherin，SK-H-M)、不表达E-cadherin的SKOV-3卵巢癌细胞悬浮MCS(MCSofSKOV-3withnoexpressionofE-cadherin，SK-N-M)和低表达E-cadherin的OVCAR-3卵巢癌细胞MCS(MCSofOVCAR-3withlowexpressionofE-cadherin，OV-L-M)在24、48、72h三个时间点的细胞增殖活性无显著差异(P＞0.05);同一时间点，SK-H-M与SK-N-M和OV-L-M的细胞增殖活性亦无显著差异(P＞0.05)。
　　4.加入顺铂72h后，三种卵巢癌细胞悬浮MCS均显著低于相应贴壁细胞的死亡率(P＜0.05);顺铂作用72h后，SK-H-M的死亡率显著低于SK-N-M和OV-L-M的死亡率(P＜0.05);顺铂作用72h后的SK-H-A的死亡率显著低于SK-N-A和OV-L-A的死亡率(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.成功构建了模拟卵巢癌细胞转移的悬浮MCS模型(SK-H-M)。
　　2.E-cadherin促进卵巢癌细胞悬浮MCS的形成和维持。
　　3.卵巢癌细胞悬浮MCS处于增殖静止状态。
　　4.卵巢癌细胞悬浮MCS的耐药性与E-cadherin表达水平呈正相关，有可能是晚期卵巢癌治疗的重要干预靶点。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

1．细胞培养和试剂

2．卵巢癌细胞的立体悬浮培养

3．钙离子剥夺实验

4．Western blot分析

5．细胞增殖活性检测

6．细胞耐药性检测

7．统计学处理

结果

3．1．不同卵巢癌细胞E-cadherin表达水平及其形态特点的差异

3．2．卵巢癌细胞立体悬浮MCS模型的建立

3．3．E-cadherin促进卵巢癌细胞悬浮MCS的形成

3．4．卵巢癌细胞悬浮MCS处于增殖静止状态

3．5．卵巢癌细胞悬浮MCS的耐药性与E-cadherin表达水平呈正相关

讨论

结论

附图

参考文献

第二部分 多细胞球体在肿瘤转移和耐药过程中的作用研究进展

致谢

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