抑制素和JAK/STAT信号途径关系因子在甲壳动物免疫反应中的功能研究

摘要

甲壳动物是重要的经济养殖动物，甲壳动物的养殖与捕捞量占世界水产品总量的百分之十。然而，近年来水产病害频发使水产养殖业蒙受了巨大的损失。为了防控甲壳类水产养殖中病害的发生，对它们先天免疫机理的深入研究是很有必要的。虽然经过近20年的不懈努力，甲壳动物先天免疫的研究取得了显著的成果，但距离真正解决水产病害这一难题还有一定的距离，很多先天免疫的分子机制还有待揭示。
　　本论文中，作者从克氏原螯虾中鉴定出一种抑制素，发现其能够抑制病毒复制。还初步探讨了对虾JAK/STAT信号通路的组成以及在对虾细菌免疫中的功能与调控。
　　1.克氏原螯虾抑制素参与抗病毒免疫的研究
　　抑制素(Prohibitins，PHBs)是一类在真核生物中广泛表达的，具有很高保守性的蛋白质。它与细胞凋亡、癌症、细胞死亡、应激反应、细胞增殖以及免疫调控等众多生命反应有关。但是，PHB在甲壳动物免疫中的功能报道还很少。本研究中从克氏原螯虾中鉴定出一种抑制素，生物信息学分析确定其为抑制素1，命名为PcPHB1。PcPHB1在小龙虾各组织中广泛表达，在白班综合征病毒(WSSV)刺激后其在核酸水平和蛋白水平的表达量都有明显的提高。研究发现，在病毒刺激下，与对照组相比PHB1重组蛋白能够明显的降低克氏原螯虾的死亡率。同时，当用RNA干扰的方法在龙虾体内敲降PHB1的表达，并感染WSSV后，克氏原螯虾的死亡率明显增加。拯救实验（即在PHB1干扰后，向克氏原螯虾体内注入PHB1重组蛋白，之后再使克氏原螯虾感染病毒）表明，PHB1重组蛋白能够减少克氏原螯虾的死亡率。为了进一步研究PHB1抗病毒免疫的分子机制，我们检测了PHB1与病毒蛋白的相互作用。Pull-down和Far-western等实验表明，PHB1可能同病毒的囊膜蛋白VP24、VP26和VP28相互作用。据报道VP28参与病毒侵染宿主细胞的过程，能够帮助病毒进入宿主细胞。VP26在病毒装配过程中发挥了重要作用，而VP24在病毒感染的早期发挥作用。因此，PHB1可能通过与病毒囊膜蛋白VP28、VP26和VP24的相互作用，抑制病毒的侵染和病毒感染后病毒的组装。这是甲壳动物PHB1参与抗病毒免疫的首次报道。
　　2.日本对虾信号转导与转录激活信号通路(JAK/STAT)参与细菌免疫的研究
　　JAK-STAT信号通路是一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。该信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。近年来发现细胞因子信号转导抑制子(Suppressorofcytokinesignaling，SOCS)是一类STAT诱导表达的STAT的抑制因子(SSI)，它能够负调控JAK/STAT信号通路。在果蝇中，JAK/STAT信号通路与其发育和细胞及体液免疫反应有关。在对虾中，有报道称在ployIC以及PGN刺激下，STAT能够被诱导上调表达。在凡纳滨对虾中，WSSV刺激下STAT发生磷酸化，并且STAT磷酸化后进入细胞，调控效应分子的表达。JAK/STAT信号通路在甲壳动物中参与细菌免疫反应的报道很少，其参与抗细菌免疫的分子机制还有待阐明。在本研究中，我们鉴定了日本囊对虾JAK/STAT通路的四种成分，包括膜受体MjDome，膜受体配体MjIL-CTL，信号转导与转录激活子MjSTAT和细胞因子信号通路抑制因子MjSOCS2。它们有类似的组织分布，都在心、腮和肠中有较高的表达水平。MjSTAT和MjSOCS2在弧菌刺激后有上调表达的趋势。为了研究该途径的功能，作者首先建立了对虾中该途径的标志:弧菌刺激能够引起STAT的磷酸化。进一步研究发现弧菌表面分子脂多糖(LPS)可以诱发STAT的磷酸化过程。同时，本研究鉴定到LPS的可能的受体(MjIL-CLT)介导了LPS与JAK/STAT信号通路的受体Dome的结合。我们用LPS作为诱导剂，筛选出五种被JAK/STAT通路特异性调控的抗菌肽，包括ALF4、ALF5、ALF6、Cru3和Cru4。STAT被干扰后，对虾对细菌的清除能力减弱，对虾的死亡率增加。作者还对JAK/STAT途径的调控进行研究，发现SOCS2能够抑制STAT的磷酸化过程。SOCS2被干扰后，对虾对细菌的清除能力增强，对虾的死亡率减少。这些结果表明，JAK/STAT信号通路通过调节抗脂多糖因子和甲壳肽等抗菌肽的表达参与细菌免疫过程。
　　3.日本对虾一种含有跨膜结构域的甲壳肽参与细菌免疫的研究
　　甲壳肽(Crustins)是甲壳动物中特有的、含有乳清酸蛋白结构域、一般具有抑制蛋白酶和抑制细菌活性的抗菌肽。在本研究中，我们从日本囊对虾中克隆并鉴定了一种新型的甲壳肽，它含有一个信号肽，一个跨膜结构域和一个乳清酸蛋白(wheyacidicprotein，WAP)结构域，命名为MjMCru。MjMCru在心脏、鳃、胃和肠中有较高的表达水平，在血细胞和肝胰腺中表达量较低。在弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后MjMCru在血细胞中的表达量明显增加。在对虾体内注射MjMCru的WAP多肽，能够有效的减少弧菌和金黄色葡萄球菌刺激下对虾的死亡率。进一步研究发现，MjMCru能够通过同细菌表面多糖分子（如LPS、PGN和LTA）结合，而结合于细菌表面。在对虾体内注射WAP多肽能够增强对虾血细胞对弧菌和金黄色葡萄球菌的吞噬作用。这些结果表明，MjMCru在抗细菌免疫中发挥着重要作用。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 综述

免疫系统

先天免疫

1．抑制素研究进展

2．JAK／STAT信号通路的研究进展

3．抗菌肽的研究进展

4．本研究的目的

第二章 克氏原螫虾抑制素抑制白斑病毒复制

一．引言

二．材料与方法

1．菌株，载体，试剂，仪器

2．白斑病毒感染小龙虾及组织材料的收集

3．基因克隆及其序列分析

4．组织分布及其表达模式分析

5．重组表达和多克隆抗体的制备

6．蛋白水平的组织分布和表达模式分析

7．PHB1重组蛋白抑制白斑病毒复制的体内实验

8．RNA干扰实验

9．使用Far-Western技术检测PHB1与病毒蛋白的相互作用

10．Pull-down，CoIP实验

11．免疫细胞化学实验

12．三维模型分析

13．免疫胶体金实验

三．结果

1．PHB1序列分析与鉴定

2．PHB1的组织分布

3．PHB1在病毒刺激后的表达模式

4．病毒复制抑制试验

5．PHB1干扰和干扰后蛋白拯救时病毒复制检测

6．小龙虾存活率统计

7．PHB1与WSSV的囊膜蛋白VP24、VP26以及VP28相互作用

8．PHB1与VP28的相互作用的3D模型

9．PHB1黏附在WSSV的表面

四．讨论

第三章 JAK／STAT信号通路参与对虾的抗细菌免疫

一．引言

二．材料与方法

1．菌株，载体，试剂，仪器

2．实验动物与免疫刺激

3．基因克隆，表达纯化与抗体制备

4．基因软件分析与鉴定

5．实时定量PCR检测组织分布与表达模式

6．细菌结合实验

7．多糖结合实验

8．Pull-down实验

9．RNAi实验

10．细菌清除实验

11．死亡率统计

12．Western blot实验

13．免疫细胞化学实验检测MjSTAT的细胞定位

14．AMPs筛选

15．MjSOCS2和INH5抑制STAT磷酸化

三．结果

1．基因克隆与表达

2．MjIL-CTL、MjDome、MjSTAT和MjSOCS2的组织分布

3 弧菌刺激后MjIL-CTL、MjDome、MjSTAT和MjSOCS2在肠中的表达模式

4．MjIL-CTL能够与细菌相互作用

5．MjIL-CTL与MjDome的结合实验

6．弧菌表面分子能够诱导STAT的磷酸化

7．STAT被磷酸化前后亚细胞定位的检测

8．MjDome参与STAT信号途径

9．JAK／STAT通路调控抗菌肽的表达

10．MjSTA T和MjSOCS2在抗弧菌免疫中的作用

四．讨论

第四章 一种含跨膜域的甲壳肽参与细胞吞噬作用

一．引言

二．材料与方法

1．菌株，载体，试剂，仪器

2．实验动物与免疫刺激

3．基因克隆与鉴定

4．重组表达和抗体的制备

5．MjMCru亚细胞定位

6．实时定量PCR和Western blot分析MjMCru表达模式

7．液体抑菌实验

8．细菌结合实验

9．多糖结合实验

10．死亡率统计

11．细胞吞噬实验

三．结果

1．基因的克隆与鉴定

2．MjMCru的组织分布

3．MjMCru的亚细胞定位研究

4．MjMCru被弧茵和金黄色葡萄球菌诱导上调表达

5．WAP结构域抑制细菌的增殖

6．MjMCru能够通过结合细菌的PAMPs结合细菌

7．MjMCru多肽能够提高细菌刺激时对虾的存活率

8．MjMCru参与了细胞对细菌的吞噬过程

四．讨论

总结和创新点

参考文献

致谢

在读期间发表的文章