DNA序列周期规律对核小体定位及滑动影响的体外实验研究

摘要

在真核生物细胞中，基因组DNA与组蛋白相互作用形成核小体。组蛋白H2A、H2B、H3、H4各两分子聚合形成八聚体，约147-bp的DNA在其上以左手螺旋的方式缠绕约1.65圈，构成核小体核心颗粒。核小体定位是指组蛋白八聚体在基因组DNA双螺旋上精确位置。核小体定位对DNA复制、修复、重组及可变剪接等众多生物学过程起着调控作用。核小体定位受到DNA序列内在特性及诸如染色质重塑、组蛋白变体、组蛋白修饰、转录因子及RNA聚合酶竞争等外在因素的影响，其中DNA序列特性是影响核小体定位最为重要的因素之一。
　　研究发现，影响核小体定位的DNA序列内在特征包括DNA序列模体、polyA、TA10-bp周期性等因素。以色列科学家Trifonov EN教授通过分析多种模式生物的核小体DNA序列特征，提出RRRRRYYYYY序列模体可能是一种有利于核小体形成的元件，其中R是嘌呤，Y是嘧啶，简称为R5Y5模体。该模体提出后，在国际上引起了较大争议，但是缺乏直接有效的实验验证。
　　实验基于影响核小体定位的DNA序列TA10-bp周期性和R5Y5序列模体，设计了6条对组蛋白亲和性不同的DNA序列，将其克隆到重组质粒中，分别命名为CS1-CS6。6条序列中，CS2和CS3同时具有TA10-bp周期和R5Y5模体，而CS1没有TA10-bp周期性，CS4-CS6没有R5Y5模体。理论上讲，CS2和CS3对组蛋白的亲和性最高，同样条件下组装核小体的效率可能最大。在引物上标记Cy3荧光信号分子，通过PCR扩增的方法获得了大量标有Cy3荧光信号的CS序列。同时，从大肠杆菌中表达纯化了H2A、H2B、H3、H4、H2A.Z及H3.3六种组蛋白，经复性装配成三种组蛋白八聚体。利用盐透析法将目的DNA序列与组蛋白八聚体组装成核小体结构，通过检测Cy3荧光信号，分析不同的CS序列形成核小体的效率。并加入染色质重塑因子ACF蛋白驱动核小体在含有CS的DNA序列上滑动，以探讨含有CS的DNA序列核小体定位及核小体滑动的规律。
　　实验建立了Cy3荧光标记检测体外组装核小体效率的实验方法。通过比较Cy3荧光标记与EB染色方法检测CS序列组装核小体的效率，发现实验采用的Cy3标记DNA技术检测核小体组装效率更加便利、灵敏且准确。将含有游离DNA及核小体DNA的电泳条带分别定量化处理，可以进一步计算DNA序列形成核小体过程的吉布斯自由能变化。
　　实验结果证实R5Y5模体可能是一种有利于核小体形成的DNA序列元件。在同样的条件下，在6条CS序列上分别组装成常规核小体、含组蛋白变体H2A.Z或H3.3的核小体。Cy3荧光标记检测发现，含有R5Y5模体的CS2和CS3序列形成核小体的效率最大，吉布斯自由能相对最小，即R5Y5模体的存在可能促进了核小体的形成。
　　初步建立了体外ACF蛋白驱动的核小体滑动实验体系。实验设计了三种组装核小体及核小体滑动的CS序列模板，均有效地装配形成了核小体结构。在CS6核心序列下游存在122-bp的DNA序列模板上组装核小体结构后，加入ACF蛋白反应，可以观察到较为明显的核小体滑动现象。该实验方法的建立对核小体结构及相关表观遗传学领域的研究具有一定的意义。