马齿苋酰胺生物碱标准化提取物和马齿苋酰胺E抗老年性痴呆活性研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)又称老年性痴呆，是老年期痴呆的主要类型之一，其症状表现为患者记忆和认知能力不同程度丧失，行为活动发生障碍。AD的发生与衰老密切相关，60岁以上人群的AD患病率是5.1％。如何防治AD，已经成为政府、医疗机构和制药行业关注的热点问题。目前AD治疗尚无特效药物，中药和天然药物为抗AD药物的发现提供了丰富的资源。
　　马齿苋（Portulaca oleracea L.）又名长寿菜，是我国传统的药食两用的植物，其地上部分药用，具有清热解毒、凉血止血的作用。大量文献表明，马齿苋具有显著的清除自由基、抗氧化和神经元保护作用，可改善D-半乳糖(D-galactose，D-gal)诱导的脑老化AD小鼠的学习和记忆能力。但是，目前马齿苋抗AD作用的药效物质基础尚不清楚。
　　马齿苋化学成分种类众多，酰胺生物碱是其中一大类活性成分。前期工作表明部分酰胺生物碱具有显著的自由基清除和神经元保护作用。四氢异喹啉生物碱马齿苋酰胺E(Oleracein E，OE)在马齿苋总酰胺生物碱中含量相对较高，且与吡拉西坦（Piracetam,PA）等临床AD治疗药物结构类似，均为吡咯烷酮衍生物。我们推断马齿苋酰胺生物碱和OE可能是马齿苋抗AD作用的重要药效物质基础。鉴于此，本课题对马齿苋酰胺生物碱标准化提取物(PAAs)和OE体内抗AD活性进行评价，并探讨其作用机制。
　　我们利用皮下注射150mg/(kg·d)D-gal及300、500和1000mg/(kg·d)D-gal60天构建脑老化AD昆明小鼠模型，从小鼠认知功能和脑氧化应激水平等方面评价该模型，均未能成功构建AD动物模型。
　　利用腹腔注射大剂量D-gal(1250mg/(kg·d))和亚硝酸钠(NaNO2，90mg/(kg·d)）8周，我们成功建立了脑老化AD昆明小鼠模型，并分别从体重、生存率、认知功能、器官指数、脑组织及血浆生化指标和海马组织形态学及凋亡相关蛋白表达等方面，分别对灌胃低剂量PAAs(L-PAAs，360mg/(kg·d)）和高剂量PAAs(H-PAAs，720mg/(kg·d))8周以及灌胃低剂量OE(L-OE，3mg/(kg·d))和高剂量OE(H-OE，15mg/(kg·d))8周的抗AD活性进行评价，结果表明:
　　(1)与D-gal/NaNO2模型组相比，吡拉西坦（PA，阳性对照）、L-PAAs和H-PAAs均可显著提高小鼠生存率(p=0.001，p=0.001，p=0.001);增加新异环境中小鼠站立次数（P=0.000，P=0.015，P=0.006）;水迷宫实验中，L-PAAs和H-PAAs可显著降低逃避潜伏期（P=0.040，P=0.033），增加目标象限停留时间和平台所在区的穿越次数（P=0.002，P=0.005;P=0.002，P=0.011），其改善学习记忆能力的作用与PA相当。此外，L-PAAs和H-PAAs还可显著减轻D-gal/NaNO2诱导肾肿大的症状(P=0.017，P=0.009)。H-PAAs可使AD小鼠脑和血浆中SOD活性代偿性升高恢复至正常水平(p=0.000，p=0.000);同时，PA、L-PAAs和H-PAAs均可显著提高AD小鼠血浆中CAT的活性(p=0.001，p=0.009，p=0.003)，减少血浆中MDA的含量(p=0.000，p=0.010，p=0.002)，PA和H-PAAs还可显著降低脑组织中MDA的含量(p=0.027，p=0.005)。总之，PAAs可缓解AD小鼠体内的氧化应激，降低脂质过氧化水平，保护海马神经细胞，从而改善小鼠的学习和记忆能力。此外，PAAs还具有保肾和延长生命周期的作用。
　　(2)与D-gal/NaNO2模型组相比，OE可显著提高小鼠存活率(90％)，其作用优于PA组(75％)。OE还具有调节机体新陈代谢的功能，可促进排尿和排便。行为学结果表明，H-OE可明显缩短AD小鼠逃避潜伏期（P=0.056），增加目标象限停留时间和平台所在区的穿越次数（P=0.023，P=0.048），其改善学习和记忆功能与PA相当，但L-OE对学习记忆损伤无作用。此外，PA、L-OE和H-OE可使AD小鼠脑中T-AOC、SOD活性和GSH含量代偿性增高恢复至正常水平(P=0.059，P=0.013，P=0.000;P=0.039，P=0.051，P=0.015;P=0.084，P=0.010，P=0.008)，同时，L-OE还可显著提高AD小鼠脑和血浆中CAT活性（P=0.016，P=0.006），PA也可显著提高血浆中CAT活性（P=0.024）。但H-OE对CAT无显著影响。进一步研究发现，H-OE和PA可上调小鼠海马神经细胞Bcl-2的表达，抑制促凋亡基因Bax和Caspase-3的高表达，从而抑制神经细胞凋亡，L-OE抑制凋亡的作用较弱。总之，H-OE通过缓解小鼠脑内氧化应激水平，抑制海马神经细胞凋亡从而保护了D-gal/NaNO2诱导的海马神经细胞损伤，提高了小鼠的学习和记忆能力。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 概述

1．1 马齿苋的研究进展

1．1．1 马齿苋的化学成分简介

1．1．2 马齿苋的药理活性最新研究进展

1．2 吡咯并异喹啉类生物碱的研究进展

1．3 老年性痴呆动物模型研究进展

1．3．1 基于衰老学说的老年性痴呆模型

1．3．2 基于神经递质学说的老年性痴呆模型

1．3．3 基于病理生理机制的老年性痴呆模型

1．3．4 基于铝中毒学说的老年性痴呆模型

1．3．5 多因素结合的老年性痴呆模型

第二章 马齿苋酰胺生物碱标准化提取物抗老年性痴呆活性的初步研究

2．1 前言

2．2 实验材料

2．2．1 马齿苋酰胺生物碱标准化提取物(PAAs)

2．2．2 实验动物

2．2．3 仪器

2．2．4 试剂

2．2．5 主要试剂的配制

2．3 实验方法

2．3．1 动物分组与处理

2．3．2 行为学测试

2．3．3 生化指标的测定

2．3．4 数据处理

2．4 实验结果

2．4．1 体重和生存率

2．4．2 行为学测试结果

2．4．3 生化指标的测定结果

2．5 小结与讨论

第三章 不同剂量D-半乳糖致小鼠老年性痴呆模型的研究

3．1 前言

3．2 实验材料

3．2．1 实验动物

3．2．2 仪器

3．2．3 试剂

3．2．4 主要试剂的配制

3．3 实验方法

3．3．1 动物分组与处理

3．3．2 行为学测试

3．3．3 生化指标的测定

3．3．4 数据处理

3．4 实验结果

3．4．1 体重和生存率

3．4．2 行为学测试结果

3．4．3 器官指数的测定结果

3．4．4 生化指标的测定结果

3．5 小结与讨论

第四章 马齿苋酰胺生物碱标准化提取物抗老年性痴呆活性研究

4．1 前言

4．2 实验材料

4．2．1 实验动物

4．2．2 仪器

4．2．3 试剂

4．2．4 主要试剂的配制

4．3 实验方法

4．3．1 动物分组与处理

4．3．2 行为学测试

4．3．3 生化指标的测定

4．3．4 海马组织形态学的检测

4．3．5 数据处理

4．4 实验结果

4．4．1 体重和生存率

4．4．2 行为学测试结果

4．4．3 器官指数的测定结果

4．4．4 生化指标的测定结果

4．4．5 海马组织形态学检测结果

4．5 小结与讨论

第五章 马齿苋酰胺E抗老年性痴呆活性研究

5．1 前言

5．2 实验材料

5．2．1 实验动物

5．2．2 仪器

5．2．3 试剂

5．2．4 马齿苋酰胺E水溶性的测定

5．2．5 主要试剂的配制

5．3 实验方法

5．3．1 动物分组与处理

5．3．2 行为学测试

5．3．3 生化指标的测定

5．3．4 海马组织形态学及免疫组化检测

5．3．5 数据处理

5．4 实验结果

5．4．1 体重和生存率

5．4．2 代谢指标的测定结果

5．4．3 行为学测试结果

5．4．4 器官指数的测定结果

5．4．5 生化指标的测定结果

5．4．6 海马组织形态学及免疫组化检测结果

5．5 小结与讨论

参考文献

致谢

硕士研究生期间发表的论文